1，25（OH）-,2-D-,3-對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：腎臟纖維化包括腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化，是各種原發(fā)、繼發(fā)腎小球疾病和非腎小球疾病所致腎臟疾病終末期的共同表現(xiàn)。大量研究表明腎間質(zhì)纖維化程度對長期腎功能來說更為重要，因此腎間質(zhì)纖維化越來越多地受到人們的重視。如何防治腎間質(zhì)纖維化成為目前腎臟病領(lǐng)域的研究熱點之一。作為抑制腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)因子的肝細胞生長因子(HGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)，目前在腎臟領(lǐng)域頗受重視。HGF在腎臟主要表達于腎間質(zhì)細胞、腎小球內(nèi)皮細胞和巨噬細胞，

2、以內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌的形式特異性作用于靶細胞，發(fā)揮其對腎臟的保護作用。而BMP-7屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族，它不僅在腎臟的發(fā)生作用中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并且可以治療多種腎小管和腎間質(zhì)疾病。伴隨抑制纖維化因子而來的致纖維化因子TGF-β1的高表達參與腎間質(zhì)纖維化的各個步驟，其誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路激活是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal TransitionEMT)機制中最為重要的環(huán)節(jié)，抑制轉(zhuǎn)化

3、生長因子-β1(TGF-β1)在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，可能是一種有效的防治纖維化的手段。1，25(OH)<,2>D<,3>作為維生素D(VitD)經(jīng)肝、腎代謝后的主要活性形式，具有很重要的生物學(xué)活性。在維持機體正常鈣磷代謝及骨的正常發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。然而，近年來隨著對1,25(OH)<,2>D<,3>的不斷研究，其腎臟保護作用已不僅僅局限于對血鈣、磷和PTH水平的調(diào)節(jié)，但其確切機制尚未明了，對于這種新機制的研究有助于重新評價1

4、，25(OH)<,2>D<,3>在治療腎臟病中的意義。單側(cè)輸尿管接扎(UUO)是一成熟的腎間質(zhì)纖維化模型，腎小球病變不明顯，本試驗以此動物模型為平臺，選用1，25(OH)<,2>D<,3>干預(yù)，通過觀察腎臟病理改變、免疫組織化學(xué)方法檢測HGF、BMP-7、TGF-β1的表達變化，從細胞水平探討1，25(OH)<,2>D<,3>抗腎間質(zhì)纖維化，保護腎功能的機制。 方法：選擇清潔級健康雄性Wistar大鼠54只，體重(200±10)

5、克，隨機分為三組：假手術(shù)組(A組)，輸尿管結(jié)扎組(UUO組即B組)，1，25(OH)<,2>D<,3>治療組(C組)，每組各18只。每組又因于術(shù)后第3、7、14天分批處死而分為N<,3>、N<,7>、N<,14>組，每組各6只。將各組大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左側(cè)輸尿管，在中上1/3處用4號線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，以防逆行性感染，假手術(shù)組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其他手

6、術(shù)過程同前。術(shù)后各組大鼠均正常飲食。1，25(OH)<,2>D<,3>治療組大鼠以0.1 mL1，25(OH)<,2>D<,3>混懸液9ng/100g/d灌胃，1次/日；假手術(shù)組和UUO組大鼠用等量花生油灌胃，1次/日三組均于術(shù)前一天開始灌胃至術(shù)后第3天、第7天和第14天，分三批留取標本。輸尿管結(jié)扎術(shù)后分別于第3、7、14天處死，大鼠處死前留取血標本，檢測血清鈣(Ca)、磷(P)濃度，迅速取出左腎，按冠狀位縱形切開，取腎組織的1/2置于

7、10％福爾馬林固定液固定，酒精逐級脫水，二甲苯透明石蠟包埋，制成5um切片。光鏡HE、Masson染色觀察腎臟病理變化。采用免疫組織化學(xué)染色測定腎間質(zhì)BMP-7、HGF、TGF-β1的表達，結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。實驗結(jié)果均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：與A組相比，B組及C組的血Ca、P輕度升

8、高但無統(tǒng)計學(xué)差異。光鏡下觀察，HE及Masson染色A組未見異常，B組及C組各時相點大鼠腎臟腎小球無明顯變化。HE染色B組術(shù)后3天腎小管擴張不明顯，間質(zhì)中少量單核細胞與淋巴細胞浸潤，腎間質(zhì)寬度增加；B組7天可見。腎小管擴張明顯，上皮細胞變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見萎縮腎小管；B組14天上述病變加重，可見彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中大量淋巴單

9、核細胞浸潤，纖維化較明顯。Masson染色可見B組術(shù)后3天腎小管擴張，腎間質(zhì)寬度增加，膠原纖維增加，染色加深；此后，病變逐漸加重。C組與B組平行相比腎小管間質(zhì)病變程度明顯減輕，腎間質(zhì)相對面積明顯減少(P<0.01)。三組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：BMP-7在A組高度表達，腎臟髓質(zhì)區(qū)表達明顯高于皮質(zhì)區(qū)的表達，主要分布于腎小管及腎間質(zhì)，在升支小管上皮、遠曲小管、集合管均有表達，在直部及皮髓質(zhì)交界處染色最強，

10、近曲小管僅有少量表達，而在腎小球內(nèi)基本無表達。在B組各時相點BMP-7蛋白的表達隨時間呈進行性下降，且隨著梗阻時間延長減弱程度更加明顯，第14天表達最弱，幾乎無明顯陽性表達。B組組間及與A組同時相點相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。C組術(shù)后第3天、第7天、第14天BMP-7的表達均顯著高于同時期B組的表達(P<0.05)。HGF在腎小管間質(zhì)的表達：在A組各時期均幾乎無表達。在B組、C組主要表達于腎小管上皮細胞，腎間質(zhì)有少量表達，3天時

11、HGF表達較正常輕度增高，7天時表達至高峰，14天時表達減少，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。C組與B組同時相點相比HGF的表達均增高，組間、組內(nèi)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。TGF-β1在腎小管間質(zhì)的表達：在A組各時期僅腎小球、腎小管間質(zhì)微量表達，主要分布于腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)，B組各時相點TGF-β1蛋白的表達隨時間呈進行性升高，且隨著梗阻時間延長升高程度更加明顯，至第14天表達最強。組間、組內(nèi)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。進一步

12、對各組BMP-7、HGF蛋白的表達與TGF-β1的表達進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，BMP-7、HGF與TGF-β1的表達均顯著負相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論：本實驗進一步證實了BMP-7、HGF及TGF-β1的表達部位及其表達與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。且1，25(OH)<,2>D<,3>能夠明顯減輕腎間質(zhì)纖維化，上調(diào)BMP-7、HGF蛋白的表達，進而使TGF-β1的表達下降，從而發(fā)揮其在單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中對腎臟的保護作用，延緩和抑制