肝細胞生長因子對單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要決定因素。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及多種細胞因子及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。腎小管間質(zhì)病變及其嚴重程度往往決定著腎臟疾病的預(yù)后。因此，探討腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制及防治措施具有重要的臨床意義。轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor。TGF-β1)在多種纖維化疾病中均發(fā)揮強效的致纖維化作用。TGF-β1通過促進足細胞、內(nèi)皮細胞、小管上皮細胞及間質(zhì)成纖維細

2、胞產(chǎn)生大量的基質(zhì)成份，.以及腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展成為終末期腎衰竭?；罨厥荏w樣激酶(Activin Receptor-like Kinase)家族，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，特別是ALK5對于活化的TGF-β1發(fā)揮其生物學(xué)活性至關(guān)重要。提示ALK5與慢性腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ALK5受體能夠活化其下游的Smad及P38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated prot

3、ein kinase P38 MA PK)信號通路，將TGF-β1信號傳導(dǎo)至細胞內(nèi)，促進細胞外基質(zhì)(extracelluarmatrix,ECM)沉積。肝細胞生長素(Hepatocyte growth factor HGF)作為一種多效性因子，對于腎損傷后腎小管的修復(fù)與再生至關(guān)重要。HGF通過抑制TGF-β1的表達；抑制成纖維細胞活化及細胞外基質(zhì)的過度生成；加速細胞外基質(zhì)降解；阻斷腎小管上皮-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化；抑制細胞凋亡；促進細胞增

4、殖等方面，發(fā)揮腎臟保護作用。注射用促肝細胞生長素(Hepatocyte Growth-promoting Factors for Injection)是從動物肝臟中提取的小分子多肽類活性物質(zhì)，目前主要應(yīng)用于重癥肝炎和早期肝硬化的臨床治療。迄今為止，國內(nèi)外尚未見促肝細胞生長素對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral occlusion,UUO)大鼠模型腎組織HGF、TGF-β1、ALK5表達影響的研究。本實驗以UUO大鼠模

5、型為研究對象，觀察腎臟組織病理改變，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測HGF、TGF-β1、ALK5的表達情況，同時應(yīng)用促肝細胞生長素進行干預(yù)，探討腎間質(zhì)纖維化中HGF、TGF-β1，、ALK5的表達變化及促肝細胞生長素對其影響，為臨床防治腎間質(zhì)纖維化提供試驗性理論依據(jù)。 方法：選擇清潔級健康雄性Wistar大鼠54只，體重(200±10)克，隨機分為三組：假手術(shù)組(正常對照組，A組)，單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO組，B組)，促肝細胞生長素

6、干預(yù)組(C組)，每組各18只。每組又因于術(shù)后第3、7、14天分批處死而分為N3、N7、N14組，每組各6只。將B、C組大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左側(cè)輸尿管，在中上1/3處用4號線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，以防逆行性感染。A組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其他手術(shù)過程同前。C組大鼠以促肝細胞生長素0.5mg/(Kg·d)腹腔注射，1次/日；A和B組大鼠用等容積生理鹽水腹腔注射，1

7、次/日，三組均于術(shù)前一天開始注射至術(shù)后第3天、第7天和第14天，實驗期間自由進食水。術(shù)后第3天、7天、14天各組隨機選取6只大鼠分三批頸椎離斷處死，后立即取出大鼠左腎組織，分別用蘇木素伊紅(HE)、Masson染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理變化，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。采用免疫組織化學(xué)方法測定腎間質(zhì)HGF、TGF-β1、ALK5的表達，結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。實驗結(jié)果均以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，各組間比較采

8、用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：光鏡下觀察，HE及Masson染色A組未見異常。HE染色可見B組及C組各時相點大鼠腎臟腎小球均無明顯變化。B組術(shù)后3天腎小管擴張不明顯，可見腎間質(zhì)炎癥細胞局灶浸潤，腎間質(zhì)寬度增加；第7天腎小管擴張明顯，上皮細胞變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見萎縮腎小管；第14天上

9、述病變加重，可見彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中大量淋巴單核細胞浸潤，纖維化較明顯。Masson染色可見B組術(shù)后3天腎小管擴張，腎間質(zhì)寬度增加，膠原纖維增加，染色加深；此后，病變逐漸加重。C組與B組平行相比腎小管間質(zhì)病變程度明顯減輕，腎間質(zhì)相對面積明顯減少(P＜0.05)。三組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：TGF-β1在A組在腎小管間質(zhì)、腎小球微量表達。

10、在B組各時相點TGF-β1的表達隨時間呈進行性升高，且隨梗阻時間延長表達逐漸上調(diào)。B組組間及與A組同時相點相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。C組術(shù)后第3天、第7天、第14天TGF-β1的表達均顯著低于同時期B組的表達(P＜0.05)，但仍高于同期A組(P＜0.05)。ALK5在A組各時期均幾乎無表達。在B組主要表達于腎小管上皮細胞，腎間質(zhì)有少量表達，隨著梗阻時間的延長，腎間質(zhì)纖維化程度的加重，ALK5的表達逐漸增多，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

11、0.05)。C組與B組同時相點相比ALK5的表達均減少，組間、組內(nèi)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。HGF在A組各時期均幾乎無表達。在B組主要表達于腎小管上皮細胞，于第3天表達最高，第7天稍有回落，第14天表達最弱，但均高于同期A組(P＜0.05)。與同期B組相比，C組術(shù)后第3天、第7天、第14天HGF的表達均顯著高于同時期B組的表達(P＜0.05)。 結(jié)論：在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)中TGF-β1、ALK5的表達明顯升高，且隨著