腦淋巴引流阻滯對缺血性腦損傷的影響及機(jī)制.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.量化腦淋巴引流。2.建立永久性局灶性腦梗塞和腦淋巴引流阻斷模型，通過觀察腦淋巴引流阻斷前后缺血大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)水平的變化，來探討基質(zhì)金屬蛋白酶9對腦缺血的影響及機(jī)制。3.觀察腦梗塞后給予腦淋巴引流阻斷對缺血大鼠腦水腫和梗塞體積的影響并探討其機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法：1.腦皮質(zhì)內(nèi)微量注射伊文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合物，于注射后0、0.5、1、3、6、9、12、18、24和48h處死動(dòng)物，作頸淋巴結(jié)勻漿和熒光檢測。甲酰胺

2、法提取頸淋巴結(jié)勻漿中的伊文氏藍(lán)，按照公式：腦淋巴引流量=頸淋巴結(jié)伊文氏藍(lán)含量/微量注射入腦內(nèi)的伊文氏藍(lán)量來量化腦皮質(zhì)淋巴引流。2.線栓法制備大鼠永久性局灶性腦缺血模型和阻斷頸部淋巴引流的方法建立腦淋巴引流阻斷模型，在規(guī)定的時(shí)點(diǎn)觀察動(dòng)物術(shù)后大腦組織中以下指標(biāo)的變化：干濕重法評(píng)價(jià)大鼠的腦水腫程度；伊文氏藍(lán)外滲法測定血腦屏障通透性變化；酶譜印跡技術(shù)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9的酶學(xué)活性；原子吸收法測定干燥腦組織中Ca2+含量變化；2，3，5-三苯基四

3、氮唑(TTC)染色評(píng)價(jià)缺血腦組織的梗塞程度；組織勻漿法檢測大腦皮質(zhì)中谷氨酸含量；Northern印跡技術(shù)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9和N-甲基-D-天冬氨酸受體1的mRNA表達(dá)水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.腦皮質(zhì)內(nèi)微量注射伊文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合物后，0和48h時(shí)頸淋巴結(jié)處未檢測到伊文氏藍(lán)，但0.5h時(shí)含量明顯增加，12h時(shí)最多，不同時(shí)點(diǎn)伊文氏藍(lán)的含量不同。熒光檢測發(fā)現(xiàn)，腦皮質(zhì)內(nèi)單純注射伊文氏藍(lán)或白蛋白，頸淋巴結(jié)處均無熒光信號(hào)，但注射入伊

4、文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合物后，有熒光現(xiàn)象，且不同時(shí)點(diǎn)熒光強(qiáng)度不同，以12h時(shí)最強(qiáng)。 2.正常組和假手術(shù)組大鼠的腦含水量、EB含量、MMP-9的熒光強(qiáng)度、酶學(xué)活性和mRNA的表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)點(diǎn)無明顯變化。腦淋巴引流阻斷前后缺血區(qū)腦組織的含水量自術(shù)后12h明顯升高，以MCAO+CLB組大鼠更明顯。與假手術(shù)組同一時(shí)點(diǎn)相比，MCAO組在12、24和48h的p值均小于0.05；與MCAO+Sham-CLB組同一時(shí)點(diǎn)相比，MCAO+CLB組在上述

5、時(shí)點(diǎn)的P值均小于0.05；腦淋巴引流阻斷前后缺血區(qū)腦組織的EB含量明顯增高，且峰值在24h,以MCAO+CLB組最明顯。MCAO組大鼠在12、24和48h的EB含量明顯高于假手術(shù)組，且12h時(shí)的P值小于0.05，而其他時(shí)點(diǎn)的P值均小于0.01；MCAO+CLB組大鼠在24和48h的EB含量明顯高于MCAO+Sham-CLB組大鼠，相應(yīng)的P值均小于0.05，這說明CLB可明顯提高M(jìn)CAO組大鼠BBB的通透性；MCAO組大鼠大腦皮質(zhì)MMP-

6、9的熒光強(qiáng)度在各個(gè)時(shí)點(diǎn)明顯高于假手術(shù)組大鼠；MCAO+Sham-CLB組和MCAO組無明顯差異；而MCAO+CLB組則明顯高于MCAO+Sham-CLB組，MMP-9主要表達(dá)于皮質(zhì)細(xì)胞的胞膜、胞漿及血管壁；酶譜分析表明，腦缺血后皮質(zhì)區(qū)MMP-9的活性明顯增加，24h達(dá)峰值，持續(xù)到48h，腦淋巴引流阻斷后，缺血區(qū)MMP-9的活性增加更明顯；MMP-9northern印跡分析表明，MCAO、MCAO+Sham-CLB和MCAO+CLB組大鼠

7、的MMP-9mRNA水平于6h開始升高，24h達(dá)峰值，持續(xù)到48h，且MCAO+CLB組從6h到48h均明顯高于同一時(shí)點(diǎn)的MCAO+Sham-CLB組的mRNA表達(dá)水平。 3.腦組織內(nèi)Ca2+含量在正常組和假手術(shù)組無明顯變化，但其他組24h時(shí)明顯升高且持續(xù)到96h。在MCAO組，Ca2+含量在24、48、72和96h與同一時(shí)點(diǎn)的假手術(shù)組相比，分別增加83.34﹪、91.67﹪、113.08﹪和142.11﹪(p＜0.05在24和

8、48h，p＜0.01在72和96h)。在MCAO+CLB組，Ca2+含量在24、48、72和96h與同一時(shí)點(diǎn)的MCAO+Sham-CLB組相比，分別增加42.22﹪、38.19﹪，34.27﹪和32.68﹪(p＜0.05)；TTC染色發(fā)現(xiàn)，MCAO和MCAO后給予腦淋巴引流阻斷均引起大鼠腦梗塞體積明顯增加，以MCAO+CLB組大鼠為明顯(p＜0.05在72和96h)；在各個(gè)時(shí)點(diǎn)，正常組和假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)谷氨酸含量無明顯變化，但在MCA

9、O、MCAO+Sham-CLB和MCAO+CLB組，則顯著升高，峰值分別為(1.37±0.27)ng/mg.pro、(1.39±0.22ng/mg.pr)ng/mg.pro和(2.01±0.31)ng/mg.pro。谷氨酸含量3h(MCAO和MCAO+Sham-CLB組)或6h(MCAO+CLB組)達(dá)高峰，然后迅速降低，24h時(shí)恢復(fù)正常水平且持續(xù)到96h；MCAO組大鼠大腦皮質(zhì)NMDAR1的熒光強(qiáng)度在各個(gè)時(shí)點(diǎn)明顯高于假手術(shù)組，而MCAO

10、+CLB組則明顯高于MCAO+Sham-CLB組，NMDAR1主要表達(dá)于皮質(zhì)細(xì)胞的胞膜；NMDAR1northern印跡分析表明，NMDAR1mRNA的表達(dá)水平在正常組和假手術(shù)組較低，但在MCAO、MCAO+Sham-CLB和MCAO+CLB組顯著上調(diào)：3h(MCAO組，p＜0.01對假手術(shù)組)或6h(MCAO+CLB組，p＜0.01對MCAO+Sham-CLB組)達(dá)峰值，然后迅速恢復(fù)到正常水平，24h又上調(diào)且持續(xù)到96h。 實(shí)

11、驗(yàn)結(jié)論： 1.運(yùn)用腦皮質(zhì)內(nèi)微量注射伊文氏藍(lán)-白蛋白復(fù)合物的方法可量化不同時(shí)點(diǎn)腦淋巴引流的量、速度；大約17﹪的腦淋巴液通過腦皮質(zhì)淋巴引流途徑引流到頸部淋巴系統(tǒng)；腦淋巴引流量在12h時(shí)達(dá)到峰值。 2.腦淋巴引流阻斷可提高大鼠缺血腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9的酶學(xué)活性和mRNA的表達(dá)水平；腦淋巴引流阻斷后，缺血大鼠腦水腫程度的加重和血腦屏障通透性的提高與基質(zhì)金屬蛋白酶9水平上調(diào)有關(guān)。 3.腦淋巴引流阻斷通過提高腦含水量、