涎腺腺樣囊性癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株基因表達(dá)譜及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)差異初步分析.pdf

1、目的：探討限制性片段差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment Differential Display—Polymerase Chained Reaction，RFDD-PCR)技術(shù)用于大范圍初步篩選與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因的可行性，確定進(jìn)一步研究的相關(guān)候選基因，為下一步研究打好基礎(chǔ)，同時(shí)為今后更深入的研究涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制提供新線索。 觀察部分篩選出的候選基因在涎腺腺樣囊性癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞

2、株以及裸鼠移植瘤中的表達(dá)，初步探討其在涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機(jī)制。 方法：人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-M和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-2由上海第九人民醫(yī)院口外腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。其中ACC-M為ACC-2經(jīng)體外和裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)分離出的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆株，這兩個(gè)細(xì)胞株遺傳背景相同，只有轉(zhuǎn)移能力相差較大。 抽提符合要求的兩細(xì)胞株總RNA，使用RFDD-PCR技術(shù)，通過平行操作，構(gòu)建兩個(gè)具有相同遺傳背景，但轉(zhuǎn)移能力

3、相差較大的細(xì)胞株基因表達(dá)譜。應(yīng)用高電壓垂直電泳系統(tǒng)，以60W的恒定功率，在6％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，分離表達(dá)的基因片段，再配合高靈敏度的熒光成像系統(tǒng)Typhoon 9200，佐以圖像分析軟件ImageQuant TL，Image Tool，GeneTools，F(xiàn)ragment Analysis軟件等對(duì)凝膠的圖像進(jìn)行分析，確定表達(dá)片段與差異表達(dá)片段數(shù)目。 通過生物信息學(xué)方法對(duì)兩個(gè)細(xì)胞株基因表達(dá)譜的差異進(jìn)行分析，初步確定與涎

4、腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(或EST)，尋找有價(jià)值的候選片段。 通過半定量RT-PCR用ACC-M、ACC-2細(xì)胞株對(duì)篩選出的候選基因的差異表達(dá)進(jìn)行觀察。 用半定量RT-PCR、免疫組化方法檢測(cè)ACC-M、ACC-2細(xì)胞株裸鼠移植瘤的MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)情況，并比較其差異。 結(jié)果：RFDD-PCR電泳圖像顯示，條帶大小集中在50～1000bp之間，條帶間界線清晰，各

5、條帶間分離效果好。兩個(gè)細(xì)胞株共獲得有意義的條帶5420條，其中ACC-M細(xì)胞株2619條，ACC-2細(xì)胞株2801條。以GeneTools軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，有差異的片段為1734條，差異條帶為總條帶數(shù)的32％。與ACC-2細(xì)胞株的表達(dá)相比，ACC-M細(xì)胞株表達(dá)信號(hào)增強(qiáng)的基因片段433條，表達(dá)減弱的基因片段562條；ACC-M細(xì)胞株出現(xiàn)的基因片段416條，消失的基因片段323條；達(dá)到了構(gòu)建表達(dá)譜的要求。 在將圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為生物信

6、息學(xué)數(shù)據(jù)的過程中，比較了各種擬合曲線后，發(fā)現(xiàn)以POWER方程擬合度最佳，相關(guān)系數(shù)(R<'2>)均超過0.983。通過生物信息學(xué)分析，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的5420個(gè)條帶的基因進(jìn)行初步對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，涎腺腺樣囊性癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株基因表達(dá)涉及：跨膜糖蛋白、離子通道蛋白、生長(zhǎng)因子及其受體、細(xì)胞因子、信號(hào)傳遞分子、細(xì)胞周期蛋白、代謝酶、與增殖和凋亡相關(guān)的基因，等等。 進(jìn)一步差異分析發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶家族中MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP

7、-15、MMP-20、MMP-28在ACC-M中的表達(dá)高于ACC-2；MMP-14、MMP-24在ACC-M中的表達(dá)低于ACC-2；MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在ACC-M和ACC．2之間的表達(dá)接近。鈣粘素家族中CDH11、CDH12在ACC-M表達(dá)高于ACC-2；CDH2、CDH4、CDH5、CDH10、CDH19在ACC-M表達(dá)低于ACC-2；CDH1、CDH9、CDH13、CDH20在兩細(xì)胞株中無差異； C

8、DH3、CDH6、CDH8在ACC-M不表達(dá)而在ACC-2有表達(dá)。整合素ITGB4、ITGB7在ACC-M表達(dá)低于ACC-2；ITGB2在兩細(xì)胞株中無差異；ITGB3、ITGB 5、ITGB 8在ACC-M不表達(dá)而在ACC-2有表達(dá)。KAI1在ACC-M明顯低于在ACC-2的表達(dá)。 半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)譜生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的12個(gè)基質(zhì)金屬蛋白酶基因中，MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-15在．ACC-M細(xì)胞株

9、的表達(dá)明顯高于．ACC-2，而MMP-14、MMP-24的表達(dá)ACC-M又明顯低于ACC-2。MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在兩細(xì)胞株中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-20、MMP-28沒有出現(xiàn)預(yù)期的條帶。半定量RT-PCR和免疫組化結(jié)果均顯示，MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1在ACC-M裸鼠移植瘤中的表達(dá)高于ACC-2裸鼠移植瘤的表達(dá)，而TIMP-2在兩細(xì)胞株裸鼠移植瘤表達(dá)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、 結(jié)論：根據(jù)本研究所得的ACC-M、ACC-2兩細(xì)胞株64個(gè)“表達(dá)窗”所顯示的條帶總數(shù)，以及通過生物信息學(xué)方法比較所篩選出的候選基因數(shù)目和種類，結(jié)合本課題組的其它實(shí)驗(yàn)，說明RFDD-PCR具有高靈敏性、高覆蓋率和高重現(xiàn)性，可用于大范圍疾病相關(guān)基因的初步篩選。且不受以往研究結(jié)果的限制，有利于尋找新的疾病研究切入點(diǎn)。 本課題從ACC-M、ACC-2兩細(xì)胞株共獲得有意義條帶5420條，同時(shí)觀察到兩細(xì)胞株的差異條帶達(dá)1734條，占總

11、條帶數(shù)的32％。經(jīng)生物信息學(xué)分析，差異條帶包括跨膜糖蛋白、離子通道蛋白、生長(zhǎng)因子及其受體、細(xì)胞因子、信號(hào)傳遞分子、細(xì)胞周期蛋白、代謝酶、與增殖和凋亡相關(guān)的基因，等多種基因。結(jié)果提示，僅轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的行為學(xué)變化就可能涉及腫瘤細(xì)胞功能基因組的變化，尋找診治腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)將會(huì)遇到極大的挑戰(zhàn)。 本課題結(jié)合涎腺腺樣囊性癌易于浸潤(rùn)神經(jīng)纖維的特點(diǎn)，篩選出了若干未見報(bào)道或報(bào)道不全的與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(家族成員)，并對(duì)其中的MMPs、

12、TIMPs基因家族與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)行了更深入的探討，為進(jìn)一步了解涎腺腺樣囊性癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制及臨床診療提供新線索。 本研究發(fā)現(xiàn)，ACC-M的高轉(zhuǎn)移能力可能與MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14、MMP-15和MMP-24相關(guān)。MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在兩細(xì)胞株中無差異，可能是不同的腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)存在種類和量的不同，說明不同腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力可能與不同的MMPs家族基因相關(guān)。

13、 MMP-19、MMP-20、MMP-8與涎腺腺樣囊性癌的轉(zhuǎn)移是否相關(guān)還有待進(jìn)一步證實(shí)。 同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，ACC-M與ACC-2兩細(xì)胞株在體內(nèi)和體外可能具有相同的表型，且這兩個(gè)細(xì)胞株遺傳背景相同，只有轉(zhuǎn)移能力相差較大，在基因水平上表達(dá)有明顯的差異，說明這些差異可能與轉(zhuǎn)移有關(guān)。觀察到ACC-M移植瘤細(xì)胞TIMP-1表達(dá)高于ACC-2移植瘤細(xì)胞，支持TIMP-1可能具有生長(zhǎng)因子樣作用的學(xué)說，它可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。TIMP-2在兩