涎腺腺樣囊性癌高、低轉移細胞株基因表達譜及基質(zhì)金屬蛋白酶表達差異初步分析.pdf

1、目的：探討限制性片段差異顯示聚合酶鏈反應(Restriction Fragment Differential Display—Polymerase Chained Reaction，RFDD-PCR)技術用于大范圍初步篩選與涎腺腺樣囊性癌轉移相關候選基因的可行性，確定進一步研究的相關候選基因，為下一步研究打好基礎，同時為今后更深入的研究涎腺腺樣囊性癌轉移相關機制提供新線索。 觀察部分篩選出的候選基因在涎腺腺樣囊性癌高、低轉移細胞

2、株以及裸鼠移植瘤中的表達，初步探討其在涎腺腺樣囊性癌轉移過程中可能的作用機制。 方法：人涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株ACC-M和低轉移細胞株ACC-2由上海第九人民醫(yī)院口外腫瘤實驗室惠贈。其中ACC-M為ACC-2經(jīng)體外和裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)分離出的高轉移細胞克隆株，這兩個細胞株遺傳背景相同，只有轉移能力相差較大。 抽提符合要求的兩細胞株總RNA，使用RFDD-PCR技術，通過平行操作，構建兩個具有相同遺傳背景，但轉移能力

3、相差較大的細胞株基因表達譜。應用高電壓垂直電泳系統(tǒng)，以60W的恒定功率，在6％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，分離表達的基因片段，再配合高靈敏度的熒光成像系統(tǒng)Typhoon 9200，佐以圖像分析軟件ImageQuant TL，Image Tool，GeneTools，F(xiàn)ragment Analysis軟件等對凝膠的圖像進行分析，確定表達片段與差異表達片段數(shù)目。 通過生物信息學方法對兩個細胞株基因表達譜的差異進行分析，初步確定與涎

4、腺腺樣囊性癌轉移相關的基因(或EST)，尋找有價值的候選片段。 通過半定量RT-PCR用ACC-M、ACC-2細胞株對篩選出的候選基因的差異表達進行觀察。 用半定量RT-PCR、免疫組化方法檢測ACC-M、ACC-2細胞株裸鼠移植瘤的MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達情況，并比較其差異。 結果：RFDD-PCR電泳圖像顯示，條帶大小集中在50～1000bp之間，條帶間界線清晰，各

5、條帶間分離效果好。兩個細胞株共獲得有意義的條帶5420條，其中ACC-M細胞株2619條，ACC-2細胞株2801條。以GeneTools軟件對條帶進行分析，有差異的片段為1734條，差異條帶為總條帶數(shù)的32％。與ACC-2細胞株的表達相比，ACC-M細胞株表達信號增強的基因片段433條，表達減弱的基因片段562條；ACC-M細胞株出現(xiàn)的基因片段416條，消失的基因片段323條；達到了構建表達譜的要求。 在將圖像數(shù)據(jù)轉換為生物信

6、息學數(shù)據(jù)的過程中，比較了各種擬合曲線后，發(fā)現(xiàn)以POWER方程擬合度最佳，相關系數(shù)(R<'2>)均超過0.983。通過生物信息學分析，并對發(fā)現(xiàn)的5420個條帶的基因進行初步對比分析發(fā)現(xiàn)，涎腺腺樣囊性癌高、低轉移細胞株基因表達涉及：跨膜糖蛋白、離子通道蛋白、生長因子及其受體、細胞因子、信號傳遞分子、細胞周期蛋白、代謝酶、與增殖和凋亡相關的基因，等等。 進一步差異分析發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶家族中MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP

7、-15、MMP-20、MMP-28在ACC-M中的表達高于ACC-2；MMP-14、MMP-24在ACC-M中的表達低于ACC-2；MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在ACC-M和ACC．2之間的表達接近。鈣粘素家族中CDH11、CDH12在ACC-M表達高于ACC-2；CDH2、CDH4、CDH5、CDH10、CDH19在ACC-M表達低于ACC-2；CDH1、CDH9、CDH13、CDH20在兩細胞株中無差異； C

8、DH3、CDH6、CDH8在ACC-M不表達而在ACC-2有表達。整合素ITGB4、ITGB7在ACC-M表達低于ACC-2；ITGB2在兩細胞株中無差異；ITGB3、ITGB 5、ITGB 8在ACC-M不表達而在ACC-2有表達。KAI1在ACC-M明顯低于在ACC-2的表達。 半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，在表達譜生物信息學分析發(fā)現(xiàn)的12個基質(zhì)金屬蛋白酶基因中，MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-15在．ACC-M細胞株

9、的表達明顯高于．ACC-2，而MMP-14、MMP-24的表達ACC-M又明顯低于ACC-2。MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在兩細胞株中的差異無統(tǒng)計學意義。MMP-20、MMP-28沒有出現(xiàn)預期的條帶。半定量RT-PCR和免疫組化結果均顯示，MMP-2、MMP-7、MMP-9、TIMP-1在ACC-M裸鼠移植瘤中的表達高于ACC-2裸鼠移植瘤的表達，而TIMP-2在兩細胞株裸鼠移植瘤表達之間的差異無統(tǒng)計學意義。

10、 結論：根據(jù)本研究所得的ACC-M、ACC-2兩細胞株64個“表達窗”所顯示的條帶總數(shù)，以及通過生物信息學方法比較所篩選出的候選基因數(shù)目和種類，結合本課題組的其它實驗，說明RFDD-PCR具有高靈敏性、高覆蓋率和高重現(xiàn)性，可用于大范圍疾病相關基因的初步篩選。且不受以往研究結果的限制，有利于尋找新的疾病研究切入點。 本課題從ACC-M、ACC-2兩細胞株共獲得有意義條帶5420條，同時觀察到兩細胞株的差異條帶達1734條，占總

11、條帶數(shù)的32％。經(jīng)生物信息學分析，差異條帶包括跨膜糖蛋白、離子通道蛋白、生長因子及其受體、細胞因子、信號傳遞分子、細胞周期蛋白、代謝酶、與增殖和凋亡相關的基因，等多種基因。結果提示，僅轉移能力增強的行為學變化就可能涉及腫瘤細胞功能基因組的變化，尋找診治腫瘤轉移的靶點將會遇到極大的挑戰(zhàn)。 本課題結合涎腺腺樣囊性癌易于浸潤神經(jīng)纖維的特點，篩選出了若干未見報道或報道不全的與涎腺腺樣囊性癌轉移相關的基因(家族成員)，并對其中的MMPs、

12、TIMPs基因家族與涎腺腺樣囊性癌轉移的關系進行了更深入的探討，為進一步了解涎腺腺樣囊性癌的轉移機制及臨床診療提供新線索。 本研究發(fā)現(xiàn)，ACC-M的高轉移能力可能與MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-14、MMP-15和MMP-24相關。MMP-8、MMP-11、MMP-12、MMP-19在兩細胞株中無差異，可能是不同的腫瘤細胞周圍基質(zhì)存在種類和量的不同，說明不同腫瘤細胞的轉移能力可能與不同的MMPs家族基因相關。

13、 MMP-19、MMP-20、MMP-8與涎腺腺樣囊性癌的轉移是否相關還有待進一步證實。 同時我們發(fā)現(xiàn)，ACC-M與ACC-2兩細胞株在體內(nèi)和體外可能具有相同的表型，且這兩個細胞株遺傳背景相同，只有轉移能力相差較大，在基因水平上表達有明顯的差異，說明這些差異可能與轉移有關。觀察到ACC-M移植瘤細胞TIMP-1表達高于ACC-2移植瘤細胞，支持TIMP-1可能具有生長因子樣作用的學說，它可能促進腫瘤細胞的生長。TIMP-2在兩