食血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑及其缺失突變體的構(gòu)建、表達(dá)及活性研究.pdf

1、食血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑,是美國(guó)科學(xué)家Stephen J.Gardell于1989年從南美洲吸血蝙蝠Desmodus rotundus的唾液中分離獲得,是一種組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)類(lèi)似物。該類(lèi)似物共有四種形式,分別為:DSPAa1、DSPAa2、DSPAβ、DSPAγ。其中,DSPAa含有指形(Finger)區(qū)、表皮生長(zhǎng)因子(E,與hEGF相似)區(qū)、kringle(K)區(qū)和絲氨酸蛋白酶(P)區(qū),DSPAβ含E、K、P區(qū),DS

2、PAγ只有K和P區(qū)。所有的DSPA都只有單鏈形式,具有酰胺水解活性,對(duì)纖溶酶原的激活嚴(yán)格要求血纖蛋白作為輔助因子,否則不能激活纖溶酶原。其中DSPAa1已在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、昆蟲(chóng)細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因煙草、巴斯德畢赤酵母中得到表達(dá),DSPAa2已在大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母中得到表達(dá),DSPAγ已在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中得到表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),同t-PA相比,DSPAa1的血纖蛋白依賴(lài)性和選擇特異性更高,當(dāng)血纖蛋白存在時(shí),DSPAa1的

3、催化速率將提高105倍,而t-PA僅提高550倍。DSPAa2的纖溶活性較DSPAa1低。DSPAγ具有溶栓能力,但其作用大大低于DSPAa1,即Finger和EGF區(qū)的缺失大大降低DSPAa1的活性,即結(jié)構(gòu)的改變顯著影響溶栓作用。為此,分別構(gòu)建了缺失E區(qū)的DSPAa1突變體和缺失F區(qū)的DSPAβ以及缺失E區(qū)和F區(qū)的突變體DSPAγ,目的是進(jìn)一步研究DSPA結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,確定DSPA纖溶活性的必需結(jié)構(gòu)域,為新藥的研發(fā)提供一定的理論依

4、據(jù)。
　　 本課題首先運(yùn)用小片段引物合成和片段拼接等技術(shù),人工合成包括缺失E區(qū)的DSPAa1(簡(jiǎn)稱(chēng)mDSPAa1)、DSPAβ和DSPAγ并克隆到表達(dá)載體pPIC9K上；成功構(gòu)建出mDSPAa1/pPIC9K、DSPAB/pPIC9K和DSPAγ/pPIC9K重組質(zhì)粒。然后,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115中,mDSPAa1經(jīng)過(guò)G418濃度梯度抗性篩選、小量表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)獲得一高表達(dá)菌株,目的蛋白

5、的表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上,目的蛋白的分泌量大約為30mg/L。DSPAβ小量表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)獲得一高表達(dá)菌株。對(duì)酵母工程菌mDSPAa1/GS115及DSPAβ/GS115進(jìn)行大量表達(dá),通過(guò)甲醇誘導(dǎo)分泌型表達(dá)重組蛋白mDSPAa1、DSPAβ,經(jīng)過(guò)72 h誘導(dǎo)表達(dá),離心,收集上清,65％硫酸銨沉淀,透析后,纖維平板法對(duì)其進(jìn)行活性測(cè)定。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)測(cè)定DSPAa1活性為2.64x105U/mg,mDSPAa