應(yīng)用小腸粘膜下層構(gòu)建仿生性骨膜的實驗研究.pdf

1、骨缺損是一種骨科臨床最常見的疾病之一。骨膜的內(nèi)生層細(xì)胞含有豐富的多潛能干細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞而具有成骨能力，是一種修復(fù)骨缺損傳統(tǒng)的治療方法。但自體移植存在供區(qū)來源有限，且對供區(qū)造成損傷，給病人帶來一定的痛苦；同種異體移植會引起免疫排斥反應(yīng)和傳播疾病等并發(fā)癥。 組織工程技術(shù)的發(fā)展為骨缺損的修復(fù)提供了新的思路和方法。因此，我們設(shè)想應(yīng)用組織工程的方法，來構(gòu)建真正意義上的骨膜來修復(fù)骨缺損。要構(gòu)建的仿生性骨膜必須具有生理骨膜的結(jié)構(gòu)和功能

2、，既要含有具有成骨作用的成骨細(xì)胞，又要有能使細(xì)胞良好附著、增殖、分化的可降解支架材料。因此，選擇與生理骨膜類似的種子細(xì)胞和支架材料就顯得優(yōu)為重要。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有較強(qiáng)的自我增殖能力和多向分化潛能，可以作為種子細(xì)胞。理想的骨組織工程支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性、生物降解性、多孔性和一定的機(jī)械性能，以利于細(xì)胞的粘附、生長、增殖和分化。將細(xì)胞與支架材料復(fù)合體外構(gòu)建的組織工程骨是細(xì)胞與材料的復(fù)合體，自身無營養(yǎng)來源，植

3、入體內(nèi)后，需血液一細(xì)胞間液為種子細(xì)胞提供營養(yǎng)。若植入?yún)^(qū)血供不良或植入物血管化過程較長，附著在支架上的種子細(xì)胞可因缺乏營養(yǎng)而出現(xiàn)代謝紊亂，細(xì)胞增殖、分化及分泌功能受損甚至死亡，最終導(dǎo)致移植物失效而變?yōu)閱渭兊墓莻鲗?dǎo)材料，成骨能力下降。因此，組織工程骨植入體內(nèi)后的快速血管化，是保證植入物中種子細(xì)胞成活、增殖、分泌，最終達(dá)到加快骨缺損修復(fù)的前提。豬小腸粘膜下層(SIS)是一種三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)材料，主要由I膠原組成并含有多種生長因子的膜性物質(zhì)

4、，可以支持組織早期形成大量血管，并可作為暫時的可吸收支架材料。 本實驗通過物理和化學(xué)方法制備SIS并對其進(jìn)行生物學(xué)評價，然后以SIS為支架材料構(gòu)建組織工程化骨膜，既含有成骨細(xì)胞，又含有骨膜具有的膠原成分，達(dá)到天然骨膜的結(jié)構(gòu)和功能，然后將仿生性骨膜植入兔橈骨缺損出觀察對骨缺損的修復(fù)效果，為骨缺損的治療開辟新的途徑。本課題分為四個部分組成。 一、一種組織工程化骨膜支架材料-小腸粘膜下層的制備及生物學(xué)評價 目的：了解豬S

5、IS的生物學(xué)特性并對其進(jìn)行生物學(xué)評價，探討SIS作為骨組織工程支架材料的可行性。方法：對物理及化學(xué)方法處理后的SIS進(jìn)行組織學(xué)檢測，掃描電鏡觀察其表面特性。通過熱原檢測試驗、皮膚致敏試驗、植入試驗、全身毒性試驗、細(xì)胞毒性實驗評價SIS的生物相容性，并應(yīng)用ELISA法測定SIS中轉(zhuǎn)化生長因子-β和血管內(nèi)皮生長因子含量。結(jié)果：用物理和化學(xué)方法處理后的SIS表面無細(xì)胞殘留，空隙多，膠原纖維未受損，對細(xì)胞粘附、增殖和分化無明顯的抑制作用，生物相

6、容性良好。SIS中含有轉(zhuǎn)化生長因子和血管內(nèi)皮生長因子。結(jié)論：SIS有良好的組織和細(xì)胞相容性，并且含有轉(zhuǎn)化生長因子和血管內(nèi)皮生長因子，可以用作骨組織工程的支架材料構(gòu)建出仿生骨膜。 二、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)和鑒定 目的：驗證兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在體外向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力及其成骨活性。方法：取健康成年新西蘭大白兔骨髓，分離后的細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)。通過倒置顯微鏡、透射電鏡、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、四環(huán)素?zé)?/p>

7、光觀察鈣結(jié)節(jié)、Von KOssa鈣染色和免疫熒光檢測骨鈣蛋白、骨橋蛋白等手段對獲得的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究。結(jié)果：體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，BMSC早期呈集落樣生長，逐漸可長滿瓶壁，并可呈多層生長，無接觸抑制現(xiàn)象，具有與成骨細(xì)胞相似的形態(tài)特征和生長特點。堿性磷酸酶染色和Von Kossa鈣染色陽性，骨鈣蛋白和骨橋蛋白表型陽性，具有與成骨細(xì)胞類似的功能性表現(xiàn)。結(jié)論：BMSCs在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后可表達(dá)成骨細(xì)胞表型，是一種理想的骨組織工程種子

8、細(xì)胞。 三、仿生性骨膜的體外構(gòu)建及體內(nèi)成骨的實驗研究 目的：探討以SIS作支架、復(fù)合BMSCs體外構(gòu)建組織工程骨膜及其體內(nèi)成骨的可行性。方法：將取白兔骨髓中密度梯度法分離的BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，接種在SIS上形成細(xì)胞一材料復(fù)合體，構(gòu)建組織工程化骨膜，體外復(fù)合培養(yǎng)2周后埋置于無胸腺裸鼠皮下。分別在不同時間取在體外和體內(nèi)的標(biāo)本，進(jìn)行掃描電鏡、透射電鏡、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察。結(jié)果：體外復(fù)合培養(yǎng)見細(xì)胞與材料粘附良好

9、，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞分化、增殖活躍。大體觀察體內(nèi)復(fù)合組織見顏色變白，組織硬度增加，組織學(xué)和電鏡觀察見有大量骨組織形成。免疫組化示細(xì)胞為具有分泌特異性骨鈣蛋白的成骨細(xì)胞。結(jié)論：SIS具有良好的細(xì)胞相容性，不影響B(tài)MSCs的形態(tài)，對細(xì)胞生長和功能表達(dá)沒有抑制作用，BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)與SIS復(fù)合培養(yǎng)在體外可構(gòu)建出仿生骨膜，植入裸鼠體內(nèi)后可達(dá)到自體骨膜的作用而形成骨組織。 四、組織工程化仿生骨膜修復(fù)長段骨缺損的實驗研究

10、 目的：研究仿生制備的組織工程化骨膜修復(fù)兔橈骨長段骨缺損的成骨性能、修復(fù)效果及可能的修復(fù)機(jī)制。方法：用組織工程方法將：BMSCs與SIS復(fù)合培養(yǎng)體外構(gòu)建的仿生性骨膜，制備兔橈骨完全骨膜—骨缺損模型，分為用SIS復(fù)合BMSC構(gòu)建成仿生骨膜組、自體骨膜組、單純SIS組及空白對照組四組。分別于術(shù)后4、8、12周進(jìn)行大體解剖觀察、X線觀察、HE染色及Masson三色法染色組織學(xué)觀察并進(jìn)行不脫鈣病理染色，分析骨形態(tài)結(jié)構(gòu)與成骨速度。結(jié)果：仿生骨膜與