小腸粘膜下層冷凍凝膠用于細(xì)胞移植支架的研究.pdf

1、目的:難治性、慢性創(chuàng)傷及組織缺損導(dǎo)致的疼痛、生理功能缺失、容貌的改變嚴(yán)重影響著病人的行動(dòng)自由和生活質(zhì)量，并進(jìn)一步導(dǎo)致心理和社會(huì)問題。當(dāng)自體及同種異體移植受來(lái)源、倫理及傳染疾病等限制時(shí)，組織工程修復(fù)成為必然的選擇。動(dòng)物源性的異種生物材料是組織工程材料的研究熱點(diǎn)，來(lái)源充分，安全可靠，是一種良好的再生組織材料支架，且沒有異體生物材料移植的倫理學(xué)問題，便于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化制備。其中豬小腸黏膜下層(small intestinal submuc

2、osa，SIS)有著較低的免疫源性、良好的組織相容性且富含生長(zhǎng)因子，是一種較為理想的生物源性材料。但SIS仍存在一下不足:首先SIS為薄膜狀材料，缺乏足夠的三維結(jié)構(gòu)，限制了其應(yīng)用領(lǐng)域;其次，SIS結(jié)構(gòu)致密，缺乏疏松的孔徑結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞的遷移爬行及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。
　　本研究以SIS為原材料，通過一種新的交聯(lián)改性方法，制備出了具有彈性形變能力和形態(tài)記憶功能的新型組織工程支架材料:SIS冷凍凝膠。通過掃描電鏡觀察其表面及內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，

3、了解其孔徑大小。比較不同制備參數(shù)的冷凍凝膠吸水率、體外降解率、機(jī)械性能、細(xì)胞毒性，了解冷凍凝膠的形成機(jī)制，優(yōu)選制備條件。通過體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)證實(shí)了SIS冷凍凝膠可主動(dòng)吸附細(xì)胞。細(xì)胞能在支架材料上粘附生長(zhǎng)。SIS冷凍凝膠的生物、物理性能良好，抗壓能力強(qiáng)，不易碎裂，便于移植。是一種可用于細(xì)胞及藥物移植的支架，在組織重建、創(chuàng)面修復(fù)及注射填充方面有廣泛的應(yīng)用前景。
　　方法:研究分四部分
　　第一部分:脫細(xì)胞SIS膜的制備及掃描電鏡

4、觀察
　　1.采用機(jī)械刮除及甲醇/氯仿脫脂、胰酶消化、去垢劑漂洗相結(jié)合的辦法制備脫細(xì)胞SIS膜。
　　2.掃描電鏡觀察脫細(xì)胞SIS膜表面結(jié)構(gòu)及有無(wú)細(xì)胞殘留。
　　第二部分:脫細(xì)胞SIS粉末的制各及SIS溶液濃度優(yōu)選
　　1.通過低溫粉碎后胃蛋白酶消化、過濾、鹽析、離心、透析、凍干等步驟制備脫細(xì)胞SIS粉末。
　　2.觀察不同濃度的SIS溶液性狀及流動(dòng)性，凍干制備的海綿形態(tài)，優(yōu)選SIS溶液濃度。
　　第

5、三部分:SIS冷凍凝膠的制備及性能評(píng)價(jià)
　　1.利用自制簡(jiǎn)易混勻裝置，采用冷凍交聯(lián)的方法制備了新型生物材料:具有彈性形變和形態(tài)記憶功能的SIS冷凍凝膠。
　　2.掃描電鏡觀察SIS冷凍凝膠的微觀結(jié)構(gòu)及孔徑大小。
　　3.檢測(cè)不同EDC濃度制備的冷凍凝膠吸水率、體外降解速率及機(jī)械性能。
　　第四部分:SIS冷凍凝膠體外細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)
　　1.分離培養(yǎng)新生GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚成纖維細(xì)胞。
　　2.體外復(fù)合培

6、養(yǎng)后熒光顯微鏡及掃描電鏡觀察。
　　3.以商品化膠原海綿為對(duì)照，CCK-8試劑盒檢測(cè)不同EDC濃度制備的SIS冷凍凝膠細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果:1.成功制備了脫細(xì)胞SIS膜，掃描電鏡結(jié)果提示SIS表面纖維呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未見明顯殘留細(xì)胞形態(tài)。
　　2.脫細(xì)胞SIS粉末呈白色絮狀。2mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml濃度的SIS粉末均可溶解于0.1％醋酸溶液中。SIS濃度越高，材料的形態(tài)及物理性能也越好。但SIS溶液變

7、得越來(lái)越粘稠，流動(dòng)性也越來(lái)越差。10mg/ml的濃度溶解已經(jīng)變得較為困難。更高濃度的SIS溶液磁力攪拌器轉(zhuǎn)子已經(jīng)無(wú)法轉(zhuǎn)動(dòng)，溶液不均質(zhì)，攪拌過程容易產(chǎn)生氣泡。因此我們優(yōu)選SIS溶液濃度為10mg/ml作為下一步實(shí)驗(yàn)參數(shù)。
　　3.成功制備了具有彈性形變和形態(tài)記憶功能的SIS冷凍凝膠。壓縮形變達(dá)85％以上時(shí)仍完好無(wú)損，移除外力后可迅速吸水復(fù)原。掃描電鏡提示SIS冷凍凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小介于在50-200um之間。平均孔徑大小為:(

8、106.63±28.9) um。隨著交聯(lián)制各的EDC濃度升高，SIS冷凍凝膠吸水率不變、降解速率減緩、機(jī)械性能提高。優(yōu)選EDC制備濃度為30mM-50mM。
　　4.通過無(wú)菌紗布擠壓排除并吸走內(nèi)部的水分可使SIS冷凍凝膠變扁，滴加細(xì)胞懸液后可迅速主動(dòng)回彈吸附細(xì)胞。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)，熒光顯微鏡及掃描電鏡結(jié)果均顯示SIS冷凍凝膠有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)粘附，細(xì)胞存在與支架的表面及孔壁上，呈線性、紡錘形扁平結(jié)構(gòu)。有大量偽足

9、長(zhǎng)出，部分融合成片。CCK-8試劑盒檢測(cè)提示不同EDC濃度交聯(lián)制備的SIS冷凍凝膠吸光度相同，與商品化膠原海綿支架材料無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:1.通過自制簡(jiǎn)易混勻裝置，利用水溶性零長(zhǎng)度EDC交聯(lián)劑，采用冷凍交聯(lián)方法制備的SIS冷凍凝膠具有彈性形變和形態(tài)記憶功能，是一種可注射、可降解的支架材料。較目前國(guó)外所報(bào)道的冷凍凝膠制備方法更簡(jiǎn)便，交聯(lián)條件更易控制，不需要接枝額外化學(xué)基團(tuán)，避免了化工試劑的潛在生物毒性。
　　2.SIS冷凍