SARS病毒E、M、N基因 克隆、表達(dá)及免疫原性初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建SARS病毒E、M、N基因真核及原核表達(dá)重組質(zhì)粒，評(píng)價(jià)這3種基因在SARS病毒感染快速診斷以及疫苗研制中的價(jià)值。 方法：通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得SARS-CoVE、M、N基因片斷，將其分別克隆入真核表達(dá)載體pVAX1，將所得真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-E、pVAX1-M和pVAX1-N分別肌肉注射小鼠和兔子，檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)抗SARS-CoV抗體，觀察實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物的體重變化，處死后對(duì)重要臟器進(jìn)行病理檢查。將SARS-CoVE、M

2、、N基因片斷克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，優(yōu)化表達(dá)條件、純化重組蛋白。以重組蛋白pGEX-4T-1/N為抗原，檢測(cè)真核表達(dá)重組質(zhì)粒注射動(dòng)物血清中抗體。 結(jié)果：真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-E、pYAX1-M和pYAX1-N以及原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/E、pGEX-4T-1/M和pGEX-4T-1/N基因測(cè)序結(jié)果與Genebank公布的一致。真核表達(dá)重組質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫小鼠和兔子后，在動(dòng)物體內(nèi)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性

3、抗SARS-CoV抗體。通過(guò)觀察動(dòng)物一般狀態(tài)和對(duì)重要臟器的病理研究顯示，重組質(zhì)粒安全無(wú)害。經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳可見(jiàn)pGEX-4T-1/NBL21(DE3)有特異蛋白表達(dá)帶。誘導(dǎo)后的pGEX-4T-1/EBL21(DE3)和pGEX-4T-1/MBL21(DE3)菌體沉淀以鼠抗GST.tag為一抗，進(jìn)行Westernblot，可發(fā)生免疫印劑反應(yīng)。通過(guò)westernblot分析顯示重組蛋白pGEX-4T-1/N可與小鼠重組