口蹄疫病毒P1基因和乙型腦炎病毒E基因在轉基因水稻中的表達及其免疫原性研究.pdf

1、口蹄疫病毒（FMDV）是嚴重危害豬、牛等經(jīng)濟動物的傳染病，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。預防和控制這種傳染病的主要措施是對潛在易感宿主進行大范圍全面地免疫接種。而目前用于預防口蹄疫的常規(guī)疫苗都存在潛在的散毒危險，因此研制新型疫苗迫在眉睫。
　　 乙型腦炎是一種由同本乙型腦炎病毒（JEV）侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的潛在致命性傳染病。此病可通過蚊子傳染給人類，而豬是公認的主要擴增宿主和傳染源。目前廣泛使用的無論是人乙型腦炎鼠腦純化滅活疫苗

2、，還是豬乙型腦炎滅活疫苗或減毒活疫苗因為其生產費用昂貴、缺少長期免疫力，潛在的散度風險以及可能引起的過敏反應等，而限制了這些疫苗被廣泛應用。
　　 植物可飼疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比具有無動物病原體污染、生產廉價、儲存和運輸熱穩(wěn)定等優(yōu)勢，近年成為研究的熱點。水稻作為一種生物反應器，被廣泛地用于表達人和動物病原體的抗原基因。在水稻中表達FMDV或JEV的免疫原蛋白來生產新型疫苗不失為一種經(jīng)濟實用的策略。針對以上兩種病毒，本研究通過農桿菌侵

3、染法獲得了轉口蹄疫O/ES/2001株P1基因和乙型腦炎SA14-14-2株E基因的轉基因水稻，并在小鼠模型上對植物來源的P1蛋白和E蛋白的生物學特性和免疫原性經(jīng)行了研究。具體研究內容包括：
　　 1．P1基因和E基因在水稻中的表達分析
　　 將本實驗室保存的口蹄疫O/ES/2001株P1基因和乙型腦炎SA14-14-2株E基因首先分別克隆到真核表達載體pRTL2中，再將構建成的含有雙CaMV35S啟動子和NOS終止子的

4、表達盒克隆到載體pCAMBIA1301中，分別命名為pCAMRT-P1和pCAMRT-E。用農桿菌法分別轉化水稻品種同本晴（Nipponbare），經(jīng)Southern blot，Northern blot和Western blot方法檢測，P1基因和E基因均在在水稻中成功表達。經(jīng)ELISA方法檢測，P1蛋白表達量達到0.6至1.3μ g/mg植物總可溶性蛋白，E蛋白表達量達到1.1至1.9μ g/mg植物總可溶性蛋白。
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5、．水稻來源的P1蛋白免疫原性研究
　　 將新鮮轉基因水稻葉片進行研磨，取研磨液與不完全弗氏佐劑混合腹腔注射免疫小鼠。首免后第56天，植物來源P1蛋白誘導小鼠體內產生了高水平的口蹄疫病毒特異性血清IgG抗體；中和抗體水平達到1：20.27，與大腸桿菌來源的P1蛋白誘導的中和抗體相當（1：22.4）。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株進行攻毒試驗，攻毒48小時后檢測小鼠血液中病毒清除情況顯示，100％的小鼠血液沒有引

6、起細胞病變。
　　 用水稻研磨液口服免疫的小鼠36天后，解剖小鼠并收集近胃部小腸，清洗后進行體外培養(yǎng)3天。口服免疫的小鼠體內也產生了口蹄疫病毒特異性血清IgG抗體，并且水稻來源的P1蛋白誘導的抗體水平顯著高于大腸桿菌來源的P1蛋白誘導的。小腸洗液和體外培養(yǎng)液中檢測到粘膜IgA抗體，證明植物來源的P1蛋白經(jīng)口服誘導了粘膜免疫。用106TCID50口蹄疫病毒0/ES/2001株進行攻毒試驗，攻毒48小時后檢測小鼠血液中病毒清除情況顯

7、示，只有20％-40％的小鼠血液沒有引起細胞病變。
　　 3．水稻來源的E蛋白免疫原性研究
　　 保護動物不受JEV的感染主要依靠體內抗體水平，尤其是中和抗體水平。用2中的方法免疫小鼠，動物實驗表明，植物來源E蛋白誘導小鼠體內產生了高水平的乙型腦炎病毒特異性血清IgG抗體；中和抗體水平達到1：19.2，顯著高于用大腸桿菌表達的E蛋白誘導的抗體水平（1：11.2）。
　　 口服免疫30天后，小鼠體內也產生了乙型腦炎

8、病毒特異性血清IgG抗體；小腸洗液和體外培養(yǎng)液中檢測到粘膜IgA抗體，且抗體水平顯著高于口服大腸桿菌來源的E蛋白的小鼠，證明植物來源的E蛋白經(jīng)口服誘導了粘膜免疫。
　　 以上結果明水稻作為一種生物反應器可以成功表達口蹄疫病毒P1蛋白和乙型腦炎病毒E蛋白，為進一步研究針對這兩種病毒的可飼疫苗奠定了基礎。下一步研究工作可以從以下兩個方面進行：用分子生物學的方法提高外源蛋白在水稻中的表達量，比如使用種子特異性表達的啟動子；從佐劑的使用