APP菌毛亞單位apfA基因克隆、原核表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、根據(jù)GenBank報(bào)道的豬傳染性胸膜肺炎血清1型的APPapfA基因序列(NCBI登陸號(hào)：AY235718)設(shè)計(jì)并合成引物，以細(xì)菌DNA提取試劑盒提取SC-A株的總DNA為模版，用PCR方法擴(kuò)增出長度為497bp的目的基因片段。將該基因克隆pMD18-T載體上，經(jīng)序列測(cè)定，結(jié)果表明獲得了豬傳染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株的克隆。該基因包含豬傳染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株apfA基因的全長為447個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼149個(gè)氨基

2、酸組成的功能蛋白。序列分析表明：該基因與GenBank上收錄的豬傳染性胸膜肺炎血清3型、4型和7型在編碼的氨基酸上同源性較高，均為99.3％。 將豬傳染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株apfA基因的信號(hào)肽去除后，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼apfA成熟蛋白的基因，并將該成熟蛋白基因重組到原核表達(dá)載體pET-32a(+)。經(jīng)酶切、PCR鑒定，表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒為APP的apfA基因原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21star(D

3、E3)細(xì)胞，陽性菌落篩選、SDS-PAGE分析以及Westernblot分析表明，成功構(gòu)建了APP的apfA的大腸桿菌基因工程菌株。用IPTG作為誘導(dǎo)劑對(duì)基因工程菌株進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，在分子量約為32kDa處有明顯得蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，與預(yù)期的融合APPapfA成熟蛋白大小一致。表達(dá)的蛋白質(zhì)主要以不溶性包涵體形式存在，約占菌體總蛋白的42.5％。重組成熟蛋白純化復(fù)性后，免疫小白鼠，經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨免疫次數(shù)的增加抗體滴度逐漸升高；經(jīng)