豬囊尾蚴T24基因的克隆、表達(dá)與免疫原性分析.pdf

1、從豬囊尾蚴中提取總RNA，用Oligo軟件設(shè)計(jì)T24基因特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出716bp的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體中，經(jīng)酶切鑒定、PCR分析和測(cè)序后證明，所克隆的716bp片段含T24蛋白基因完整的開放閱讀框(ORF)，其核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列與Genbank登錄的T24基因相應(yīng)序列的同源性分別是98％和100％。 將重組質(zhì)粒pGEM-T24和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1分別用EcoRⅠ

2、和SalⅠ酶切，亞克隆T24基因至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定證明，T24基因正確插入到pGEX-4T-1載體。用ITPG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting分析證實(shí)T24基因在大腸桿菌中成功表達(dá)，目的蛋白與GST形成融合形式，分子量大小為40ku左右，能被豬囊尾蚴陽(yáng)性血清所識(shí)別；將表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，其抗血清能與豬囊蟲粗抗原及

3、純化的T24重組融合蛋白產(chǎn)物發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。 將重組質(zhì)粒pGEM-T24和真核表達(dá)載體pPIC9K分別用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，亞克隆T24基因至真核表達(dá)載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽(yáng)性克隆提取pPIC9K-T24。用SalⅠ內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-T24，然后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。采用G418濃度梯度法對(duì)所有在營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基MD上生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，獲得的高拷貝重組菌株。用PCR檢