女性高危人群生殖道沙眼衣原體感染的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、本文論述了女性高危人群生殖道沙眼衣原體感染的分子流行病學(xué)： 第一章沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株庫的建立和鑒定。通過與美國疾病預(yù)防與控制中心性病控制中心合作，以及由中國性病控制中心購買等途徑，獲得了沙眼衣原體15種基本血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株。根據(jù)沙眼衣原體缺乏ATP酶，其所需能量只能依靠其他細(xì)胞提供，其為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物這一特性，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況和條件，使用McCoy細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)菌株體外培養(yǎng)的載體細(xì)胞，使用含10％小牛血清的

2、1640培養(yǎng)液進(jìn)行了McCoy細(xì)胞的培養(yǎng)、含1％。放線菌酮的沙眼衣原體培養(yǎng)液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌株的接種、培養(yǎng)和傳代、進(jìn)行了碘染色觀察細(xì)胞內(nèi)沙眼衣原體包涵體。并且通過設(shè)計(jì)特異性引物和巢式。PCR引物擴(kuò)增外膜蛋白基因、限制性內(nèi)切酶酶切、垂直電泳等實(shí)驗(yàn)鑒定各型沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株，從而在國內(nèi)建立了較為完整的沙眼衣原體基本血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株庫。 第二章沙眼衣原體質(zhì)粒擴(kuò)增和檢測方法的建立。在絕大多數(shù)沙眼衣原體中普遍存在著一種隱性質(zhì)粒(cryptic p

3、lasmid)，這種質(zhì)粒DNA約為7．5kb，基因序列非常保守，各型之間變異不到1％。在質(zhì)粒DNA上有8個(gè)開放讀碼框(open reading frames，ORF)，其中有5個(gè)ORF是有功能的。在ORFl1和ORF8之間有一個(gè)高度保守的22kb的連續(xù)重復(fù)4次的核苷酸序列，CT質(zhì)粒DNA單向復(fù)制的起點(diǎn)就在這段重復(fù)序列的附近。在每個(gè)沙眼衣原體菌體中的質(zhì)粒DNA有7～10個(gè)拷貝數(shù)，而沙眼衣原體主外膜蛋白基因(omp1)只有1個(gè)拷貝數(shù)。因此，

4、即便在CT的濃度非常低的情況下，也可以較為敏感的擴(kuò)增出質(zhì)粒DNA，以滿足檢測要求。因此針對(duì)沙眼衣原體隱性質(zhì)粒的基因片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增和檢測是在omp1基因分型研究之前，確定標(biāo)本中是否存在沙眼衣原體的最佳方法之一。本研究根據(jù)Bass 1993年的研究，結(jié)合羅氏Amplicor CT/NGR檢測試劑盒的說明，設(shè)計(jì)了CP24和CP27兩條針對(duì)沙眼衣原體質(zhì)粒的引物，并且通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床標(biāo)本的試驗(yàn)，成功擴(kuò)增出207kb的目的片段。

5、 第三章沙眼衣原體主要外膜蛋白基因(omp1)巢式PCR擴(kuò)增和RFLP檢測方法的建立。主要外膜蛋白(又稱主外膜蛋白)是沙眼衣原體外膜蛋白的主要成分，分子質(zhì)量占外膜蛋白的60％，主外膜蛋白有4個(gè)可變區(qū)(VD)和5個(gè)恒定區(qū)(CD)。 針對(duì)主外膜蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體檢測方法，將CT分為15個(gè)血清型，主外膜蛋白的VD區(qū)氨基酸序列的變化由主外膜蛋白基因(omp1)決定。CT各型的omp1基因總長度約為1.1kb左右，各型的長

6、度略有不同?；趏mp1基因的PCR-RFLP技術(shù)和基因測序等都能便捷的進(jìn)行大規(guī)模樣本的CT基因分型的流行病學(xué)研究。因此利用omp1基因DNA分型方法，可描述不同型的CT感染在人群、時(shí)間和地域上的分布情況。由于omp1基因在CT中是單份拷貝的，相比較質(zhì)粒PCR擴(kuò)增而言，擴(kuò)增難度更大。因此需要敏感性較高的擴(kuò)增和檢測技術(shù)。本章主要內(nèi)容是針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床標(biāo)本進(jìn)行基于omp1基因PCR擴(kuò)增的DNA提取方法的優(yōu)化選擇、初步PCR和巢式PCR引物

7、設(shè)計(jì)及篩選、反應(yīng)體系的建立和反應(yīng)條件的優(yōu)化。目的在于提高CT感染標(biāo)本omp1的擴(kuò)增敏感性。同時(shí)，本課題使用標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)粒PCR的反應(yīng)體系及omp1基因的反應(yīng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增，并且取得很好的效果，由此在每步PCR擴(kuò)增反應(yīng)中將標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)粒PCR設(shè)立為陽性對(duì)照。 第四章基于沙眼衣原體基因分型方法的性病淋巴肉芽腫臨床病例的診斷。對(duì)一例具有性病淋巴肉芽腫(lymphogranuloma venereum，LGV)臨床特點(diǎn)的患

8、者進(jìn)行臨床資料的綜合分析，包括淋巴結(jié)活檢、陰道鏡檢查、Clearview衣原體快速檢測，并通過PCR技術(shù)擴(kuò)增沙眼衣原體主要外膜蛋白o(hù)mp1的基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Alu I酶切，限制性內(nèi)切酶多態(tài)性(RFLP)對(duì)沙眼衣原體分型，并對(duì)omp1基因的恒定區(qū)CD3、CD5，以及可變區(qū)VD4進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增并測序，對(duì)感染株進(jìn)行分型，確定為L3型沙眼衣原體感染。 第五章沙眼衣原體基因分型的臨床流行病學(xué)研究。通過針對(duì)omp1基因PCR-RFL

9、P分型的方法研究國內(nèi)女性高危人群生殖道CT感染的基因型分布。研究人群包括了性病門診女性患者和女性工作者(包括羈押和娛樂場所的性工作者)，研究地點(diǎn)分布在中國南部的深圳和廣州、東部的上海和南京、西南部的成都和南寧六個(gè)城市。為了研究男性和女性人群中的衣原體基因型分布差異，在南寧的性病門診收集女性宮頸標(biāo)本的同時(shí)收集了324份男性尿道拭子標(biāo)本，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)男性和女性CT感染者中基因型分布的差別。在收集的1770例女性宮頸拭子標(biāo)本中，共檢測出質(zhì)粒陽性

10、標(biāo)本240例，其中226例標(biāo)本的ompl基因成功擴(kuò)增。在分型結(jié)果中，血清型E(n=63，27.9％)、F(n=53，23.5％)、G(n=28，12.4％)和D(n=25，11.1％)最為流行。F型感染與小年齡組和單身婚姻狀況的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G型與下腹痛關(guān)系密切，47.5％的E型感染者為無癥狀感染。這些研究結(jié)果提供了國內(nèi)高危女性人群中CT感染型別分布的基本情況，同時(shí)結(jié)果也表明包括無癥狀感染在內(nèi)的這些高危女性人群面臨多種型別衣原體感