不同基因型沙眼衣原體對(duì)生殖道感染致病性差異的實(shí)驗(yàn)與臨床研究.pdf

1、目的:
　　1.建立不同基因型沙眼衣原體(Ct)小鼠生殖道感染模型，觀察不同基因型別引起小鼠生殖道局部黏膜組織變化的差異。
　　2.分析衣原體熱休克蛋白60(cHSP60)和衣原體蛋白酶/蛋白酶樣活性因子(CPAF)表達(dá)的差異及其與局部黏膜組織變化的相關(guān)性，探討不同基因型別Ct引起生殖道黏膜損傷的可能機(jī)制。
　　3.研究不同基因型Ct女性生殖道感染與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性;比較不同基因型Ct感染宮頸分泌物中cHSP60和CP

2、AF表達(dá)的差異。
　　方法:
　　1.小鼠Ct感染模型的建立
　?、偃∨R床泌尿生殖道標(biāo)本培養(yǎng)鑒定并測(cè)序分型，分離E、F、J、K、H型Ct株，擴(kuò)大培養(yǎng)后計(jì)數(shù)包涵體并調(diào)整包涵體濃度，制備Ct懸液。②20只6～7周齡雌性Balb/c小鼠分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、無(wú)孕酮對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組（每組5只），實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組于接種前10d、3d皮下注射醋酸甲羥孕酮2.5mg，實(shí)驗(yàn)組及無(wú)孕酮對(duì)照組分別陰道接種30μl F型Ct懸液(2.

3、5×107 IFU/ml)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組陰道接種30μl衣原體保存培養(yǎng)基(SPG)，空白對(duì)照組不做任何處理。在接種后4d、7d分別取陰道-宮頸口分泌物，用細(xì)胞培養(yǎng)、直接免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)Ct感染的存在。于接種后7d取宮頸組織，電鏡觀察病變組織中Ct的存在。
　　2.小鼠生殖道不同基因型Ct感染的致病性差異
　　105只6～7周齡雌性Balb/c小鼠分為空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及五組實(shí)驗(yàn)組（每組15只），孕酮處理實(shí)驗(yàn)

4、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組后，各取30μl E、F、J、K、H型Ct懸液(2.5×107 IFU/ml)用上述方法分別接種于五組實(shí)驗(yàn)組小鼠陰道內(nèi)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組陰道接種30μl SPG，空白對(duì)照組不做任何處理。在接種后4d、7d、10d、14d、17d、21 d分別取陰道-宮頸口分泌物，用細(xì)胞培養(yǎng)、直接免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測(cè)Ct陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間。接種后7d、35 d分別取宮頸子宮輸卵管組織，切片后HE染色觀察炎癥嚴(yán)重程度。ELISA分別檢測(cè)7d陰

5、道-宮頸分泌物和35 d子宮輸卵管組織勻漿中cHSP60和CPAF表達(dá)。
　　3.女性不同基因型Ct感染與臨床表現(xiàn)相關(guān)性的初步研究
　　收集女性Ct感染標(biāo)本，巢式PCR擴(kuò)增外膜蛋白Omp1基因的VS1-VS2序列，擴(kuò)增產(chǎn)物基因測(cè)序分型。ELISA檢測(cè)不同基因型沙眼衣原體感染宮頸分泌物中cHSP60和CPAF表達(dá)，分析不同基因型沙眼衣原體感染與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠Ct感染模型的建立
　

6、?、俪晒ε囵B(yǎng)并測(cè)序鑒定出E、F、J、K、H五個(gè)基因型別臨床株，通過傳代培養(yǎng)收集到高濃度的Ct懸液(2.5×107IFU/ml)。②成功建立Ct臨床株小鼠生殖道感染模型，接種后第4d、7d用三種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)小鼠陰道-宮頸分泌物均證實(shí)感染率為100％，接種后7d電鏡觀察可見小鼠宮頸黏膜上皮內(nèi)Ct的存在。
　　2.小鼠生殖道不同基因型Ct感染的致病性差異
　?、傩∈箨幍?宮頸口分泌物中Ct持續(xù)陽(yáng)性時(shí)間五組實(shí)驗(yàn)組的中位天數(shù)均為7天，

7、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②宮頸黏膜炎癥反應(yīng)程度（接種Ct后7d）E組比J、K、H組重(P＜0.05);接種Ct后35 d，J、K、H組小鼠上生殖道出現(xiàn)嚴(yán)重的組織病理學(xué)改變，表現(xiàn)為子宮腫脹、積膿積液，輸卵管擴(kuò)張積水、纖維化、管腔變窄等，E、F組小鼠未見明顯上述改變。③小鼠接種Ct后7d，E組分泌物中cHSP60表達(dá)顯著高于其余各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組(P＜0.05)，但F、J、K、H組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;E組CPAF表達(dá)

8、高于H組和J組(P＜0.05);但F、J、K組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。小鼠接種Ct后35d，E組cHSP60表達(dá)低于其余各實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，H組cHSP60表達(dá)高于E組、F組、J組(P＜0.05);H組CPAF表達(dá)高于E組、F組、J組(P＜0.05)，但E、F、J組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。④實(shí)驗(yàn)組cHSP60和CPAF水平在接種Ct后7d、35 d均呈明顯正相關(guān)（r值分別為0.647和0.661，P＜0.0

9、5）。cHSP60、CPAF水平分別與局部黏膜炎癥反應(yīng)程度呈明顯正相關(guān)(P＜0.05)。
　　3.女性不同基因型Ct感染與臨床表現(xiàn)相關(guān)性的初步研究
　　①60例女性生殖道Ct感染陽(yáng)性標(biāo)本中E型14例(23.33％)，J型14例(23.33％)，F(xiàn)型13例(21.67％)，G型9例(15％)，D型5例(8.33％)，不確定型5例(8.33％)。②女性生殖道J型Ct感染患者宮頸分泌物中cHSP60及CPAF表達(dá)均顯著高于E型、F

10、型、G型及D型(P＜0.05);cHSP60水平E型高于G型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;CPAF表達(dá)E型明顯高于G型和D型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③女性泌尿生殖道不同基因型Ct感染者間的臨床表現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Ct基因型別間致病性存在一定差異，且不同感染時(shí)期表現(xiàn)不同。E、F型Ct主要引起宮頸黏液膿性分泌物，上行感染不明顯;J、K、H型Ct感染早期癥狀不明顯，但容易出