小鼠胚胎體外培養(yǎng)研究.pdf

1、哺乳動物早期胚胎的體外培養(yǎng)是胚胎工程技術(shù)中一個重要的環(huán)節(jié)。無論是在闡明早期胚胎的發(fā)育機理、制作轉(zhuǎn)基因動物等研究領(lǐng)域，還是在生產(chǎn)領(lǐng)域為胚胎移植提供大量可移植胚胎等方面都發(fā)揮著舉足輕重的作用。國內(nèi)外學(xué)者在該領(lǐng)域已經(jīng)進行了大量卓有成效的研究。但是到目前為止體外培養(yǎng)的哺乳動物早期胚胎，高質(zhì)量的囊胚發(fā)育率還不高，都還遠遠不能滿足人們生產(chǎn)和研究的需求。近年來，大多數(shù)的研究者都將注意力放到了培養(yǎng)液配方改良的研究上，而忽略了胚胎的培養(yǎng)方法對胚胎體外培養(yǎng)

2、的貢獻。事實上胚胎在體內(nèi)的發(fā)育環(huán)境是動態(tài)的，并有輸卵管上皮細胞的支持。本研究旨在設(shè)計創(chuàng)新一種動態(tài)的物理培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察與檢測胚胎體外發(fā)育情況，以便支持并改善早期胚胎的體外發(fā)育效果。本試驗自制了流動培養(yǎng)裝置實現(xiàn)了對胚胎的動態(tài)培養(yǎng)，以昆明小白鼠為實驗材料，研究比較了流動培養(yǎng)、開放式培養(yǎng)和常規(guī)微滴培養(yǎng)三種方法對小鼠2-細胞胚胎體外發(fā)育率的影響。同時比較了三種培養(yǎng)方法中加入輸卵管上皮細胞后的培養(yǎng)效果。試驗結(jié)果如下： 試驗一適宜流速的篩選。

3、本試驗選取了0.05ml/h、0.1ml/h、0.2ml/h三個當量的流速作為試驗流速，并分別以這三種流速對小鼠的2細胞胚胎進行了體外培養(yǎng)；以囊胚出現(xiàn)比率為檢測指標，對培養(yǎng)效果進行了觀察和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：0.05ml/h時效果較好，培養(yǎng)72小時后能獲得較高的囊胚率(73.3﹪，22/30)；0.1ml/h和0.2ml/h組分別獲得(51.6﹪，15.5/30；35﹪，10.5/30)，三組結(jié)果差異極顯著P＜0.01。后期試驗采用的流速為

4、0.05ml/h。 試驗二流動培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)和開放式培養(yǎng)三種培養(yǎng)方法培養(yǎng)結(jié)果比較。 本試驗以囊胚出現(xiàn)比率為檢測指標，對開放式培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)和流動培養(yǎng)三種培養(yǎng)方法，體外培養(yǎng)小鼠2細胞胚胎的結(jié)果進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：開放式培養(yǎng)在72小時后能獲得較高的囊胚率：75﹪(22.5/30)。流動培養(yǎng)方法較微滴培養(yǎng)方法的囊胚率略高73.3﹪(22/30)：71.7﹪(21.5/30)；三種培養(yǎng)方法的培養(yǎng)結(jié)果差異不顯著P＞0.05。培養(yǎng)

5、72小時后胚胎的退化率為：流動培養(yǎng)組最低(16.7﹪,5/30)，微滴組和開放組的退化率均為21.7﹪(6.5/30)。 試驗三輸卵管上皮細胞對三種培養(yǎng)方法的貢獻值比較。本試驗通過在三種培養(yǎng)系統(tǒng)中添加水牛輸卵管上皮細胞，來實現(xiàn)對小鼠胚胎共培養(yǎng)的目Ⅰ的。然后統(tǒng)計了三種共培養(yǎng)系統(tǒng)中胚胎囊胚率的提高比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：輸卵管上皮細胞在開放式培養(yǎng)方法中對囊胚率的貢獻值為：76.75﹪-75﹪=1.7﹪；在流動培養(yǎng)方法中對囊胚率的貢獻值為：8

6、0﹪-73.3﹪=6.7﹪，而在微滴培養(yǎng)方法中的提高效果不明顯(71.7﹪-71.7﹪=0)。 結(jié)論本實驗條件下，以流速為0.05ml/h時的流動培養(yǎng)能較好的支持小鼠的2細胞胚胎發(fā)育到囊胚階段并孵化；動態(tài)的流動培養(yǎng)同靜態(tài)的微滴培養(yǎng)和開放式培養(yǎng)對小鼠的2細胞胚胎的體外培養(yǎng)結(jié)果相近；輸卵管上皮細胞在流動培養(yǎng)裝置中對囊胚率的貢獻值，較微滴培養(yǎng)和開放式培養(yǎng)高。綜合結(jié)果表明本實驗室改進制作的早期胚胎流動培養(yǎng)體系能夠替代目前通用的靜態(tài)培養(yǎng)體