胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)

1、胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)(一)胚胎干細(xì)胞的來源目前胚胎干細(xì)胞的主要來源有：①囊胚的ICM及受精卵發(fā)育至桑葚胚之前的早期胚胎細(xì)胞；②從胚胎生殖嵴及腸系膜中分離原始生殖細(xì)胞PGCs后培養(yǎng)建系的胚胎生殖細(xì)胞(embryonicgermcells，EG細(xì)胞)，也具有ESCs的特性，可以分化為各種類型的成熟細(xì)胞；③體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(somaticcellnucleartransplantation，SCNT)至去核卵母細(xì)胞后培育出來的全能細(xì)胞。其中囊胚的I

2、CM最為常用。(二)胚胎干細(xì)胞的分離1.分離獲取ESCs的時(shí)間：以既保證ESCs的全能性又要有足夠的細(xì)胞數(shù)量為原則來確定ESCs分離獲取的最佳時(shí)間。以ICM為ESCs來源時(shí)：小鼠取3～5天囊胚；豬取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES細(xì)胞時(shí)：小鼠取12.5天胎兒生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚層組織塊、12.5天背腸系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎兒

3、生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。2.分離獲取ESCs的方法：從PGCs分離ESCs的方法常為機(jī)械剪切與消化相結(jié)合法，即把采取的胚胎組織充分剪碎，采用EDTA、EDTA胰酶消化。從囊胚分離ICM的方法主要有三種：(1)免疫外科學(xué)方法：體外培養(yǎng)的小鼠胚泡去除透明帶后，經(jīng)兔抗JCR小鼠脾臟細(xì)胞抗血清(抗H26)作用30分鐘，移至1∶6稀釋的新鮮豚鼠血清中作用30分鐘，Hank’s液沖洗，此時(shí)胚泡的滋養(yǎng)外胚層呈空泡狀，用眼科手術(shù)刀挑去死了的滋

4、養(yǎng)層細(xì)胞，留存ICM細(xì)胞用于培養(yǎng)。這種方法利用囊胚腔對(duì)抗體的不通透性，通過抗體、補(bǔ)體結(jié)合對(duì)細(xì)胞的毒性殺傷作用，去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，保留ICM細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。(2)組織培養(yǎng)法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，給予外源激素，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，但延緩著床，4～6天后，由子宮沖取胚泡進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果滋養(yǎng)層細(xì)胞生長并推開飼養(yǎng)層細(xì)胞，在培養(yǎng)皿底壁上鋪展；而ICM細(xì)胞增殖，垂直向上生長，形成卵圓柱狀結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下用細(xì)玻璃針挑出這種柱狀結(jié)構(gòu)，消化傳代。Evans

5、和Kaufman采用這種方法第一個(gè)建立了小鼠ESCs系。(3)顯微外科學(xué)方法：小鼠受精后3～4天，由子宮沖取胚泡，利用顯微操作系統(tǒng)直接從胚泡中吸出ICM細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于免疫外科學(xué)方法需要特殊的試劑去除透明帶和滋養(yǎng)層，易對(duì)內(nèi)細(xì)胞群造成損傷，而顯微外科學(xué)方法需要專門的儀器設(shè)備，且對(duì)人員的技術(shù)水平要求較高，均難以推廣應(yīng)用。組織培養(yǎng)法將胚泡接種在飼養(yǎng)層上，模擬體內(nèi)胚泡的著床，更接近自然發(fā)育過程，內(nèi)細(xì)胞群增殖旺盛，較易獲得胚胎干細(xì)胞樣集落。(三

6、)胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和建系ESCs的分離培養(yǎng)和建系是其得以應(yīng)用的前提。ESCs建系的原理是：將分離獲取的ICM或PGCs與飼養(yǎng)層共同培養(yǎng)，使之增殖而又保持其未分化狀態(tài)，這樣代代相傳從而使但仍能保持生存，并有同化培養(yǎng)液的能力，為胚胎發(fā)育提供一些必需因子，如成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子等促有絲分裂因子，LIF等細(xì)胞分化抑制因子，促進(jìn)其增殖，抑制其分化，而且可以除去體外培養(yǎng)環(huán)境中的毒素。目前常用的飼養(yǎng)層有：STO、PMEF(primar

7、ymouseembryonicfibroblast)、SNL(G418R基因和LIF基因轉(zhuǎn)染的STO)、HBC5637等。其中PMEF以其易于取材、抑分化效果好等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。制備飼養(yǎng)層時(shí)，取達(dá)到80%匯合的原代鼠胚成纖維細(xì)胞，加入含10μgml絲裂霉素C的培養(yǎng)液，作用2～4小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，用無Ca2、Mg2的Hank’s液洗滌培養(yǎng)細(xì)胞4～5次后，0.125%胰蛋白酶—0.02%EDTA消化制成細(xì)胞懸液，接種在涂有0.1%明膠的

8、四孔板中。安立龍等將小鼠ESCs置于衰老飼養(yǎng)層表面進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ESC集落松散，表面及周圍形成許多顆粒細(xì)胞、巨型細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞，認(rèn)為衰老飼養(yǎng)層能誘導(dǎo)小鼠ESCs的體外分化，所以建議使用新鮮制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞來分離培養(yǎng)ESCs。2.胚胎干細(xì)胞的獲取：(1)早期胚胎細(xì)胞培養(yǎng)法：早期胚胎細(xì)胞培養(yǎng)法是將致密桑葚胚用0.3%EDTA將其離散為卵裂球，并單個(gè)培養(yǎng)在STO(原代胎兒成纖維細(xì)胞)飼養(yǎng)層上，在培養(yǎng)48～72小時(shí)后，出現(xiàn)ESCs集落。(2

9、)胚胎與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)法：將早期胚胎如桑葚胚、囊胚、擴(kuò)張囊胚等放置在鋪有STO或3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待胚胎貼壁、透明帶脫落、ICM附著增生，出現(xiàn)鳥巢狀集落時(shí)，挑出ICM，消化ICM為細(xì)胞小塊，用等體積培養(yǎng)液或胎牛血清中和胰蛋白酶作用，將細(xì)胞小塊接種在新飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，就會(huì)獲得ESCs。(3)ICM與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)法：用免疫外科手術(shù)法剝除滋養(yǎng)層細(xì)胞，以STO細(xì)胞為飼養(yǎng)層，用ESCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)ICM細(xì)胞，也可獲得ESCs，

10、剝除滋養(yǎng)層的主要目的是防止滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)ICM細(xì)胞的競爭抑制和誘導(dǎo)分化。(4)原始生殖細(xì)胞與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)法：將原始生殖細(xì)胞PGCs接種于STO飼養(yǎng)層細(xì)胞表面，可獲得人ESCs。從人流產(chǎn)胎兒生殖嵴分離和克隆人ES細(xì)胞，克服了實(shí)驗(yàn)材料難以取得的困難，這將會(huì)促進(jìn)與人ESCs相關(guān)研究的進(jìn)行。(5)裸胚與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)：用玻璃針刺破囊胚或桑葚胚透明帶，將有破口透明帶的胚胎置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，次日，ICM就從透明帶中脫出貼附于飼養(yǎng)層。透明帶堅(jiān)固、

11、厚、不易破裂的動(dòng)物胚胎貼壁緩慢，影響ICM增殖，切除透明帶，有利于ICM增殖和ESCs形成。而透明帶薄，易于破裂的胚胎貼壁不受影響，切除透明帶等操作對(duì)ICM有不利影響，使ESCs形成率降低。(6)熱休克處理胚胎與飼養(yǎng)層共培養(yǎng)：當(dāng)胚胎在體內(nèi)發(fā)育至2細(xì)胞或桑葚胚時(shí)，從子宮中取2細(xì)胞胚胎或桑葚胚，將胚胎置于41℃持續(xù)1小時(shí)，增加胚胎ICM細(xì)胞。采用熱休克處理胚胎，桑葚胚發(fā)育至孵化胚的效率為87%，2細(xì)胞胚胎發(fā)育至囊胚的比率為85.0%。在胚胎