小鼠胚胎成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)與生長(zhǎng)特性的研究.pdf

1、飼養(yǎng)層(feeder layer)是特定的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、子宮上皮細(xì)胞、胎兒睪丸細(xì)胞等)經(jīng)絲裂霉素-C阻斷有絲分裂處理后制成的單層細(xì)胞。目前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均采用小鼠成纖維細(xì)胞(MEF和STO細(xì)胞)作為飼養(yǎng)層分離培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞(ES)。飼養(yǎng)層的存在不僅為Es細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供了一個(gè)穩(wěn)定的外環(huán)境，同時(shí)也維持了ES細(xì)胞無(wú)限增殖與分化的特性。然而衰老的飼養(yǎng)層會(huì)對(duì)ES細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響，死亡的飼養(yǎng)層細(xì)胞會(huì)釋放一些DNA碎片和溶酶

2、體的酶進(jìn)入培養(yǎng)液，干擾了ES細(xì)胞的生長(zhǎng)和正常核型的維持。本研究利用3種不同的冷凍方法對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行凍存，篩選出最佳的冷凍方案。并對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在連續(xù)傳代過(guò)程中細(xì)胞活力以及細(xì)胞骨架所發(fā)生的變化進(jìn)行追蹤觀察，確定制作飼養(yǎng)層的最佳時(shí)機(jī)。 本試驗(yàn)首先以12.5d的昆明小鼠胚胎和STO細(xì)胞為材料，對(duì)MEF進(jìn)行了分離培養(yǎng)。并通過(guò)3種冷凍方法對(duì)STO細(xì)胞和MEF細(xì)胞分別進(jìn)行冷凍，即方法A為將細(xì)胞在冰箱中平衡1h后放入-20℃冰

3、箱中過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中；方法B為將細(xì)胞迅速放入-70℃冰箱過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮中：方法C為將細(xì)胞置于液氮面上5-10cm處薰蒸20min后緩緩降入液氮中。細(xì)胞凍融后再以存活率(臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn))為主，輔以細(xì)胞相對(duì)活力測(cè)定(MTT法檢測(cè))和冷凍前后的細(xì)胞形態(tài)比較，對(duì)這3種方法的冷凍效果作以比較。以其為小鼠成纖維細(xì)胞的保存提供依據(jù)。然后對(duì)STO細(xì)胞和MEF細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)學(xué)變化，采用MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活力，并繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲

4、線；對(duì)不同代次的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，觀察其細(xì)胞骨架的變化。結(jié)果表明： 1．采用方法B凍存的細(xì)胞存活率明顯高于方法A和方法C，同時(shí)不同冷凍方法對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、相對(duì)活力的影響無(wú)明顯差異，并推斷出該實(shí)驗(yàn)中方法B為飼養(yǎng)層細(xì)胞冷凍最佳方案。 2．STO細(xì)胞在解凍后，最初幾代生長(zhǎng)較快，胞體成典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，隨傳代次數(shù)的增加，特別是9代以后，細(xì)胞逐漸排列不規(guī)則，胞內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒和空泡，死細(xì)胞增加。14代以后，部分

5、細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)溶解，胞體破碎等現(xiàn)象。MEF細(xì)胞在分離培養(yǎng)后，在最初幾代生長(zhǎng)緩慢，貼壁細(xì)胞較少；4代后生長(zhǎng)迅速，代謝旺盛，細(xì)胞形狀規(guī)則，到6代以后，細(xì)胞急劇衰亡，細(xì)胞出現(xiàn)解體，有成片的細(xì)胞漂浮或懸浮在培養(yǎng)液中。 3．解凍后的STO細(xì)胞在第5代細(xì)胞活力達(dá)到最大值，第9代出現(xiàn)下降，傳至14代又有升高。MEF分離培養(yǎng)后，細(xì)胞活力先出現(xiàn)下降，隨后上升，第5代細(xì)胞活力達(dá)最大值，6代以后細(xì)胞活力急劇下降。 4．經(jīng)激光共聚焦顯微術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)