突觸內(nèi)和突觸外NMDA受體在氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷中的不同作用.pdf

1、NMDAR(N-methyl-D-aspartatereceptors，NMDAR)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中離子型谷氨酸受體的一種類型，對(duì)Ca2+有高通透性。生理狀態(tài)的NMDAR參與細(xì)胞存活，神經(jīng)元遷移，突觸形成，突觸傳遞和突觸可塑(如學(xué)習(xí)和記憶)。急性神經(jīng)損傷如腦損傷、腦缺血、低血糖、缺氧、癲癇以及慢性神經(jīng)退化疾病中神經(jīng)元損害的病理過(guò)程也與NMDAR密切相關(guān)。 NMDAR包括NR1，NR2和NR3三種亞單位。NR1有3個(gè)剪接位點(diǎn)，能形

2、成8種異構(gòu)體。NR2分為4種亞型，分別是NR2A，NR2B，NR2C，NR2D。NR3有兩種亞型，即NR3A和NR3B。有功能的NMDAR主要由2個(gè)NR1和2個(gè)NR2亞單位組成，其中NR2亞單位決定受體的許多特性。 NMDAR各亞單位的mRNA在腦內(nèi)的分布不同，并且還有發(fā)育變化。在突觸內(nèi)外，NMDAR各亞單位的分布也存在發(fā)育變化。在發(fā)育早期突觸內(nèi)外的NMDAR主要為NR1/NR2B，其全細(xì)胞電流對(duì)NR2B的特異拮抗劑ifenpr

3、odil很敏感。 首先采用電生理方法分別記錄突觸內(nèi)NMDAmEPSC和突觸外NMDA單通道電流在發(fā)育中的變化，同時(shí)觀察NR2B的特異拮抗劑ifenprodil對(duì)突觸內(nèi)外電流的影響，以進(jìn)一步明確海馬神經(jīng)元NMDAR的發(fā)育變化。 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)一周的神經(jīng)元突觸內(nèi)mEPSC的幅度為-36.28±2.44pA(n=6)，與培養(yǎng)二周神經(jīng)元無(wú)區(qū)別(-37.13±1.83pA，n=7，P=0.780)。mEPSC的衰減符合雙指數(shù)擬合，包括一

4、快速衰減的AMPAR介導(dǎo)的成分(AMPAmEPSC)和后面跟著的一緩慢衰減的NMDAR介導(dǎo)的成分(NMDAmEPSC)。AMPAmEPSC的幅度在培養(yǎng)一周時(shí)為-24.56±1.96pA(n=6)，培養(yǎng)二周顯著增大(-31.95±1.37pA，n=7，P=0.009)，而NMDAmEPSC的幅度則顯著減小(分別是-11.72±1.71pA，-5.18±0.79pA，P=0.004)，因此NMDAmEPSC與AMPAmEPSC的比值隨發(fā)育減

5、小(分別是0.32±0.04，0.14±0.02，P=0.013)。 為了鑒定突觸內(nèi)NMDAmEPSC是由哪種NR2亞單位介導(dǎo)的，我們觀察NR2B的特異拮抗劑ifenprodil對(duì)NMDAmEPSC的影響。我們發(fā)現(xiàn)10μMifenprodil使培養(yǎng)一周的海馬神經(jīng)元NMDAmEPSC幅度顯著減小，但對(duì)培養(yǎng)二周的海馬神經(jīng)元NMDAmEPSC的抑制作用很弱。10μMifenprodil使培養(yǎng)一周的海馬神經(jīng)元mEPSC幅度平均減小-9.

6、83±1.99pA(n=6，P=0.004)，占NMDAmEPSC的80.47±6.12％，但僅使培養(yǎng)二周的海馬神經(jīng)元的mEPSC減小了12.27±2.02％(n=7)，二者之間有顯著差異(P=0.013)。由于海馬神經(jīng)元NMDAR的NR2亞單位主要表現(xiàn)為NR2A和NR2B，因此我們的結(jié)果提示培養(yǎng)一周的海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NMDAR主要為NR1/NR2B，而培養(yǎng)二周的海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NMDAR主要為NR1/NR2A異二聚體和NR1/NR2A

7、/NR2B異三聚體。 由于NMDAR也存在于突觸外，我們還檢測(cè)了突觸外NMDAR在發(fā)育中的變化。采用外面向外式記錄突觸外NMDAR介導(dǎo)的單通道電流，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)二周的神經(jīng)元開(kāi)放概率比培養(yǎng)一周神經(jīng)元增高(分別是0.18±0.02，0.11±0.03，P=0.040)，但電導(dǎo)和翻轉(zhuǎn)電位的變化無(wú)顯著性意義。電導(dǎo)分別是53.39±1.46pS(培養(yǎng)二周，n=8)和52.18±1.71(培養(yǎng)一周，n=7，P=0.559)。翻轉(zhuǎn)電位都在0m

8、V附近。培養(yǎng)一周的神經(jīng)元還出現(xiàn)低電導(dǎo)開(kāi)放。10μMifenprodil顯著減小培養(yǎng)二周神經(jīng)元與培養(yǎng)一周神經(jīng)元突觸外NMDA電流的開(kāi)放概率和電導(dǎo)。Ifenprodil阻斷了培養(yǎng)一周神經(jīng)元高電導(dǎo)開(kāi)放，對(duì)于低電導(dǎo)的作用很小。加入Ifenprodil后培養(yǎng)一周神經(jīng)元的電導(dǎo)由52.18±1.71pS降為33.97±2.37pS(n=7，P=0.002)，該電導(dǎo)與重組的及野生的低電導(dǎo)NMDAR的電導(dǎo)相似，提示培養(yǎng)一周的神經(jīng)元突觸外除了主要存在NR2

9、B亞單位外，可能有NR2D亞單位存在，因?yàn)樵诔錾暮ｑR顆粒細(xì)胞突觸外存在NR2D亞單位。Ifenprodil使培養(yǎng)二周神經(jīng)元的電導(dǎo)由53.39±1.46pS降為42.63±3.23pS(n=8，P=0.002)。Ifenprodil使培養(yǎng)一周神經(jīng)元的開(kāi)放概率降低了59.71±4.21％，使培養(yǎng)二周神經(jīng)元的開(kāi)放概率降低了79.74±3.18％，兩者有顯著差異(P=0.001)。培養(yǎng)一周神經(jīng)元開(kāi)放概率對(duì)ifenprodil敏感性比培養(yǎng)二周神

10、經(jīng)元低，可能是突觸外存在NR2D亞單位。 近來(lái)的藥理學(xué)研究提示突觸內(nèi)和突觸外NMDAR在神經(jīng)元損傷中所起的作用不同，突觸外的NMDAR促進(jìn)神經(jīng)元損傷，而突觸內(nèi)NMDAR具有一定的保護(hù)作用。因此我們分別觀察了成熟神經(jīng)元(培養(yǎng)13～15天)突觸內(nèi)和突觸外NMDAR電流在缺氧后不同時(shí)間的變化，以闡明突觸內(nèi)和突觸外NMDAR參與缺血/缺氧神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制。 為使離體缺血模型更接近于在體，我們采用氧/葡萄糖剝奪模型(Oxyg

11、en-GlucoseDeprivation，OGD)。在缺氧的同時(shí)將培養(yǎng)基換成無(wú)糖BSSo液。處理50分鐘后又換回原來(lái)的培養(yǎng)基。我們發(fā)現(xiàn)缺氧50分鐘后復(fù)氧6小時(shí)，12小時(shí)和24小時(shí)，突觸內(nèi)NMDAmEPSC的幅度均顯著減小，但各復(fù)氧組間無(wú)差異?？俶EPSC幅度與缺氧前相比無(wú)明顯變化． 我們發(fā)現(xiàn)缺氧后神經(jīng)元突觸內(nèi)NMDAmEPSC的幅度減小，而突觸外NMDA單通道電流在復(fù)氧早期對(duì)ifenprodil的敏感性降低，復(fù)氧晚期卻升高，提

12、示缺氧引起神經(jīng)元損傷的機(jī)制與突觸內(nèi)NMDAR活動(dòng)減少，突觸外NMDAR活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)。因此我們觀察了較高濃度的bicuculline(促進(jìn)突觸內(nèi)NMDAR活動(dòng))，NR2B的特異阻斷劑ifenprodil和Ro25-6981以及NMDAR的拮抗劑MK-801和d-APV對(duì)缺氧后神經(jīng)元存活的影響，以進(jìn)一步明確突觸內(nèi)和突觸外NMDAR在缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元中損傷中的作用。 我們?cè)谌毖鯐r(shí)將各種藥物加入到無(wú)糖BSSo液，氧/葡萄糖剝奪50分鐘后換

13、回正常培養(yǎng)基。復(fù)氧24小時(shí)后采用MTT比色法和hoechst33342熒光染料染細(xì)胞核法來(lái)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率。我們發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)二二周的海馬神經(jīng)元有9％左右的死亡率，單純?nèi)毖?0分鐘，細(xì)胞的活性與正常培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)差異(P=0.581，重復(fù)3次)。無(wú)糖缺氧50分鐘，死亡率為40％。10μMMK-801和500μMd-APV能顯著增加神經(jīng)元存活率(p＜0.05)，100μMd-APV只有部分保護(hù)作用。10μMifenprodil和0.5μMRo25

14、-6981也能顯著增加神經(jīng)元存活率(p＜0.05)，與MK-801和d-APV的保護(hù)作用無(wú)差別(P＞0.05)。100μMbicuculline無(wú)明顯保護(hù)作用。結(jié)合缺氧后24小時(shí)突觸外單通道電流對(duì)ifenprodil的敏感性增加，我們推測(cè)突觸外NMDAR參與了缺氧引起的神經(jīng)元損傷。 總之，我們的結(jié)果顯示缺氧后神經(jīng)元突觸內(nèi)NMDAR活動(dòng)減弱，促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用降低，而突觸外NMDAR活動(dòng)增強(qiáng)，引起神經(jīng)元死亡。我們的結(jié)果提供一種新