乙酰葛根素對缺糖缺氧大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體的作用.pdf

1、缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病，具有“三高一低”的發(fā)病特點，即高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和低死亡率，是中老年人致死和致殘的主要疾病。在人類各種疾病死因的排序中，腦血管病一直列于前三位之內(nèi)，成為人類死亡的主要原因之一。而且，由于生活水平的提高和老年人口的不斷增加，腦血管病的發(fā)病率仍在不斷上升。但因其發(fā)病機制復(fù)雜，部位特殊，至今仍無有效的理想治療藥物，因此積極尋找有效藥物，降低發(fā)病率和致殘率是醫(yī)學(xué)工作者研究的重點課

2、題。眾所周知，對于缺血性腦血管疾病，溶栓及腦保護(hù)治療仍然是當(dāng)今治療的兩大趨勢，而中藥及其有效成分在缺血性腦血管病治療中的作用正逐漸受到重視。近年的研究顯示，缺血可導(dǎo)致腦損傷，恢復(fù)血供后還可導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷，腦缺血再灌注后，神經(jīng)元的損傷反而更加嚴(yán)重，即所謂的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。目前，隨著其他器官組織特別是心肌缺血再灌損傷概念的確立，腦缺血再灌注損傷概念也逐漸發(fā)展起來。缺血性腦損傷的機理目前已提出若干學(xué)說，如興奮性氨基酸毒性學(xué)說、鈣超載學(xué)說、

3、氧自由基學(xué)說和酸中毒學(xué)說等。在這些學(xué)說中，興奮性氨基酸毒性學(xué)說具有重要的地位，并且其他學(xué)說都與它有著不同的聯(lián)系。目前，腦卒中時腦細(xì)胞的死亡已從“血供中止→無底物→無能量→細(xì)胞死亡”的認(rèn)識，向急性缺血性腦損傷存在損傷級聯(lián)反應(yīng)的認(rèn)識過渡，這其中至少涉及4個不同的機制：興奮毒性、梗死區(qū)周圍去極化、炎癥和程序性細(xì)胞死亡，其間有重疊并互相聯(lián)系。級聯(lián)反應(yīng)都從興奮毒性開始，興奮毒性是缺血性腦損傷最關(guān)鍵、最重要的環(huán)節(jié)，如果有效而迅速地阻斷級聯(lián)反應(yīng)，不僅

4、能提高急性缺血性腦卒中的臨床療效，為溶栓和降纖提供條件，而且可以延長成功再灌注的時間窗。EAA必須通過激活突觸后膜興奮性氨基酸受體起作用，因此，興奮毒性的核心是興奮性氨基酸受體的激活。大鼠神經(jīng)元有多種類型的興奮性氨基酸(EAA)受體，按其對不同激動劑的選擇性，一般分為N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)型、α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)型及其他代謝性受體。NMDA受體是配體門控性Ca<'2+>通道，對Ca<'2+>有較強的通透性，在興奮

5、性毒性方面起到了重要作用，因此，NMDA受體家族在腦缺血損傷中的作用日益受到重視。NMDA受體的磷酸化是離子通道功能調(diào)節(jié)的一種重要機制，NMDA受體由NR1、NR2(2A-2D)和NR3(A，B)亞基異聚體組成。NRl是受體通道的功能部分，NR2具有調(diào)節(jié)受體通道動力學(xué)作用，且其酪氨酸殘基可被磷酸化。許多研究證明，葛根素對冠心病、心絞痛和腦血管病具有一定療效。葛根素在體內(nèi)分布快且較廣，也可以通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，但含量較低。乙酰葛根素(化

6、合物N—2211)是葛根素經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾得到的異黃酮類化合物。我們實驗室的研究表明，乙酰葛根素能夠顯著減少腦缺血再灌注大鼠的梗死面積，改善神經(jīng)功能缺損程度，提高腦組織SOD活性，增強腦組織對自由基損傷的耐受能力，以及減少腦內(nèi)NO、MDA、內(nèi)皮素(ET)、黏附因子的生成。但乙酰葛根素是否對腦內(nèi)神經(jīng)元有直接的保護(hù)作用以及其發(fā)揮作用的具體機制尚待進(jìn)一步研究。 本實驗選用大鼠的海馬神經(jīng)元作為研究對象，旨在動態(tài)觀察具有NMDA受體的細(xì)胞受缺

7、血缺氧的影響、其NMDA受體的變化和乙酰葛根素對其本身離子通道的影響。本實驗通過動態(tài)測定缺糖缺氧再灌注海馬神經(jīng)元存活率、細(xì)胞外液興奮性氨基酸、NMDA受體結(jié)合力及其NRl亞基mRNA表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>含量，研究腦缺血缺氧后不同時間點各項指標(biāo)的變化及乙酰葛根素的作用，觀察該化合物對缺糖缺氧大鼠海馬神經(jīng)元興奮性氨基酸受體的作用及機制，探討其發(fā)揮腦保護(hù)作用的時間窗，為研究開發(fā)乙酰葛根素提供實驗依據(jù)。 選取1日齡Wist

8、ar新生大鼠，雌雄不限，75％乙醇消毒后，剝離頭皮及顱骨，取出完整腦組織，鈍性分離海馬，原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元。根據(jù)再灌注不同時間(1h，6h，12h，24h)及藥物不同濃度(1.6μmol·L<'-1>，0.4μmol·L<'-1>，O.1μmol·L<'-1>)將神經(jīng)元隨機分4大組：①正常對照組：正常換液培養(yǎng)；②低糖低氧再灌注損傷組：換以無糖Hank's液后置于缺氧盒中，并向內(nèi)通入100％N2作用2h后，換以完全培養(yǎng)基模擬體內(nèi)缺血再

9、灌注的過程。③藥物處理組：換以無糖Hank's液以后分別加入低、中、高三個濃度的乙酰葛根素，其他處理同②組。④MK-801對照組：換以無糖Hank’s液以后加入MK-801，其他處理同②組。每組細(xì)胞均在倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察低糖低氧再灌注不同時間一般形態(tài)學(xué)變化，MTT檢測不同時間神經(jīng)元活性，氨基酸分析儀測定谷氨酸含量，放射配基結(jié)合實驗測定NMDA受體結(jié)合力，PT-PCR半定量檢測NMDA受體NRl亞基mRNA的表達(dá)，熒光分光光度計測定

10、神經(jīng)元內(nèi)游離Ca<'2+>含量。 試驗結(jié)果顯示，經(jīng)乙酰葛根素處理神經(jīng)元形態(tài)改變減輕，MK-801(10μmol·L<'-1>)有相同作用；MTT結(jié)果提示乙酰葛根素可提高神經(jīng)元存活率，較MK-801作用顯著；乙酰葛根素高、中濃度及MK-801均能降低再灌注各時間點谷氨酸含量，低濃度在缺糖缺氧再灌注1h顯著降低谷氨酸含量；乙酰葛根素低、中、高濃度不同時間點的受體結(jié)合力均比損傷組降低，療效優(yōu)于MK-801；RT-PCR結(jié)果顯示除缺糖缺