緩激肽受體在神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、緩激肽(Bradykinin,BK)是由激肽釋放酶原在激肽釋放酶作用下被激活后生成的一種生物活性肽,它與其受體作用后可發(fā)揮多種生理功能,如擴(kuò)張血管、降低外周血壓、抑制平滑肌增殖等。緩激肽受體在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛,幾乎存在于所有組織中,主要有B1(B1 receptor,B1R)和B2(B2receptor,B2R)兩種亞型。在生理狀態(tài)下,動(dòng)物體內(nèi)的緩激肽受體以B2R為主,但在應(yīng)激狀況(如缺血缺氧、炎癥、外傷)下,B1R表達(dá)量明顯增高。研究

2、表明,B1R和B2R被激活后,在外周組織缺血缺氧性損傷中分別介導(dǎo)不同的作用,B1R激活表現(xiàn)為損傷加重,而B2R激活后表現(xiàn)為損傷減輕。本研究通過體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞,建立缺氧復(fù)氧模型,模擬在體缺血/再灌注過程,觀察緩激肽受體在缺氧復(fù)氧損傷中的變化,應(yīng)用B1R和B2R的特異性激動(dòng)劑和抑制劑,探討兩種受體激活后在神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中所介導(dǎo)的作用,并從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度進(jìn)一步探索其作用的深層機(jī)制。
　　 目的:研究緩激肽受體

3、在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元上的表達(dá)及缺氧后不同時(shí)期表達(dá)的變化情況,是進(jìn)一步探討緩激肽受體在細(xì)胞缺氧后各時(shí)期作用的前提和基礎(chǔ)。本文采用缺氧復(fù)氧模型,模擬體內(nèi)缺血再灌注過程,缺氧90min復(fù)氧4h,觀察緩激肽受體在神經(jīng)元的表達(dá)及缺氧復(fù)氧后的變化情況。
　　 方法:采用免疫熒光雙標(biāo)的方法,觀察緩激肽受體在神經(jīng)元的分布;RT-PCR檢測(cè)缺氧復(fù)氧不同時(shí)間B1R和B2R mRNA表達(dá)的變化;Western blot檢測(cè)缺氧復(fù)氧不同時(shí)間B1R和B2R

4、蛋白表達(dá)的變化。檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)為:缺氧前、缺氧90min、復(fù)氧1h、復(fù)氧4h、復(fù)氧12h、復(fù)氧24h。
　　 結(jié)果:1、在缺氧90min,復(fù)氧4h后,神經(jīng)元胞體腫脹,MAP-2免疫熒光染色顯示部分神經(jīng)元軸突呈串珠樣改變或斷裂,MTT結(jié)果表明神經(jīng)元存活率下降至正常培養(yǎng)狀態(tài)下的50％左右。2、體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存在緩激肽B1R和B2R的表達(dá),兩者在細(xì)胞的分布存在差異,B1R主要分布于胞膜,B2R則主要分布于核膜。3、正常培養(yǎng)狀態(tài)下的神經(jīng)

5、元B1R mRNA和蛋白表達(dá)量均很低,缺氧復(fù)氧可明顯誘導(dǎo)B1R mRNA和蛋白的表達(dá),復(fù)氧后1h左右達(dá)到高峰,之后迅速下降。正常培養(yǎng)狀態(tài)的神經(jīng)元有B2R mRNA和蛋白的表達(dá),缺氧復(fù)氧使其表達(dá)量進(jìn)一步增加,B2R mRNA表達(dá)水平在復(fù)氧后1h左右達(dá)到高峰,而B2R蛋白表達(dá)水平在復(fù)氧1-4h達(dá)峰,之后維持高表達(dá)。
　　 結(jié)論:1、缺氧模型有效,缺氧90min復(fù)氧4h可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。2、在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元上存在緩激肽B1

6、R和B2R的表達(dá),兩者在細(xì)胞分布以及缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的表達(dá)變化上存在差異,這可能是其介導(dǎo)不同生理作用的基礎(chǔ)。
　　 目的:探討緩激肽B1R和B2R激活后在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷中所介導(dǎo)的作用。
　　 方法:應(yīng)用緩激肽B1R和B2R特異性激動(dòng)劑和抑制劑,對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行干預(yù),運(yùn)用MTT法觀察B1R和B2R被激活或抑制后神經(jīng)元存活率的變化;LDH釋放試驗(yàn)觀察緩激肽B1R和B2R被激活或抑制后對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞毒性的影響;TUNEL法

7、檢測(cè)B1R和B2R被激活或抑制后對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響。
　　 結(jié)果:1、神經(jīng)元缺氧90min復(fù)氧4h后存活率下降至缺氧前的50％左右,LDH釋放顯著增加,凋亡百分比也增加。2、應(yīng)用緩激肽B1R激動(dòng)劑des-Arg9-BK能夠抑制缺氧復(fù)氧后神經(jīng)元的存活,增加神經(jīng)元的凋亡,細(xì)胞毒性作用亦增強(qiáng)。B1R激活對(duì)神經(jīng)元的損傷作用可被B1R瀟異性的抑制劑Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所部分抑制。3、緩激肽B2R激動(dòng)劑BK可激活B2

8、R,增加缺氧復(fù)氧后神經(jīng)元存活率,減少神經(jīng)元凋亡,減輕細(xì)胞毒性作用。B2R激活后介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用可被其特異性抑制劑HOE140所抑制。
　　 結(jié)論:1、缺氧復(fù)氧可引起神經(jīng)元生存率下降,LDH釋放增加,誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。2.緩激肽B1R和B2R在神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷中分別介導(dǎo)不同作用,B1R激活后表現(xiàn)為加重神經(jīng)元損傷,而B2R激活后可減輕缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。
　　 目的:1、觀察緩激肽B1R和B2R在體外培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)

9、胞中的表達(dá)及缺氧復(fù)氧后表達(dá)的變化。2、探討緩激肽B1R和B2R激活后在體外培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用。
　　 方法:應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)法,檢測(cè)緩激肽受體在體外培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)。應(yīng)用RT-PCR和Western blot方法,觀察星型膠質(zhì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧后緩激肽B1R和B2RmRNA及蛋白表達(dá)的變化。應(yīng)用緩激肽B1R和B2R特異性激動(dòng)劑和抑制劑,對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),檢測(cè)B1R和B2R激活或被抑制后對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)

10、星型膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 結(jié)果:1、體外培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞上存在緩激肽B1R和B2R的表達(dá),與神經(jīng)元上的分布相似,B1R主要表達(dá)于胞膜,而B2R主要表達(dá)于核膜。2、正常培養(yǎng)條件下星型膠質(zhì)細(xì)胞上即可以檢測(cè)到緩激肽B1R mRNA及蛋白表達(dá),但表達(dá)量較低。缺氧復(fù)氧后B1R表達(dá)迅速上調(diào),B1R mRNA表達(dá)在復(fù)氧后3h達(dá)到高峰,而蛋白表達(dá)在復(fù)氧后6h達(dá)峰,并持續(xù)在高水平表達(dá)。緩激肽B2R同樣表達(dá)于正常培養(yǎng)狀態(tài)下的星型膠質(zhì)

11、細(xì)胞,并可被缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)。在缺氧3h后,緩激肽B2RmRNA和蛋白表達(dá)水平均迅速上調(diào),之后緩慢下降,但一直維持高于基線水平。3、缺氧復(fù)氧能誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子VEGF和GDNF。4、應(yīng)用緩激肽B1R激動(dòng)劑des-Arg9-BK能夠抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)星型膠質(zhì)分泌VEGF和GDNF,這一作用可被B1R特異性的抑制劑Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所抑制。緩激肽B2R激動(dòng)劑BK可增強(qiáng)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子VEG

12、F和GDNF,而應(yīng)用B2R特異性抑制劑HOE140能夠減少其分泌。
　　 結(jié)論:1、體外培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞上存在B1R和B2R的表達(dá),并可被缺氧復(fù)氧所誘導(dǎo)。2、缺氧復(fù)氧可使星型膠質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF和GDNF增加,緩激肽B1R激活后可抑制其分泌而B2R激活后促進(jìn)其分泌。
　　 目的:應(yīng)用體外培養(yǎng)的神經(jīng)元缺氧復(fù)氧模型,探討緩激肽B1R和B2R作用的信號(hào)通路及可能的機(jī)制。
　　 方法:建立神經(jīng)元缺氧復(fù)氧模型,應(yīng)用ELI

13、SA方法檢測(cè)缺氧復(fù)氧所導(dǎo)致的神經(jīng)元上ERK1/2、JNK以及p38信號(hào)通路的激活情況。Western blot檢測(cè)緩激肽B1R和B2R特異性激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)ERK1/2、JNK以及p38信號(hào)通路磷酸化蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059、JNK通路特異性抑制劑SP600125、p38通路特異性抑制劑SB203580,觀察上述三條通路被阻斷后緩激肽B1R和B2R在神經(jīng)元缺氧復(fù)氧后作用的變化。主要觀察指標(biāo)包括:MT

14、T法測(cè)定細(xì)胞存活率,LDH法測(cè)定細(xì)胞毒性。應(yīng)用分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性,觀察緩激肽B1R和B2R激活或被抑制后對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)神經(jīng)元Caspase-3活性的影響。
　　 結(jié)果:1、缺氧后神經(jīng)元ERK1/2、JNK和p38信號(hào)通路均被激活,并隨復(fù)氧時(shí)間不同磷酸化蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)不同變化。ERK1/2通路在復(fù)氧1h左右磷酸化水平達(dá)到高峰,JNK通路磷酸化水平在復(fù)氧1-2h達(dá)峰而p38磷酸化水平在復(fù)氧30min后即達(dá)到高峰。

15、2、應(yīng)用緩激肽B1R激動(dòng)劑,可增加缺氧復(fù)氧后磷酸化JNK和p38的表達(dá),這一作用可被其特異性抑制劑Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所部分抑制。應(yīng)用緩激肽B2R激動(dòng)劑,可增加缺氧復(fù)氧后磷酸化ERK1/2表達(dá),抑制磷酸化JNK的表達(dá),并且這一作用可被其特異性抑制劑HOE140所部分抑制。3、應(yīng)用JNK特異性抑制劑SP600125,可抑制B1R激活后導(dǎo)致的神經(jīng)元LDH釋放增加,提高細(xì)胞生存率。而ERK1/2特異性抑制劑PD9805

16、9,可以抑制B2R介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用,使LDH釋放增加,降低神經(jīng)元生存率。4、缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)神經(jīng)元Caspase-3活性增強(qiáng),B1R激動(dòng)劑可使神經(jīng)元缺氧復(fù)氧后Caspase-3活性進(jìn)一步增強(qiáng),而應(yīng)用B2R激動(dòng)劑可抑制Caspase-3活性的增加。
　　 結(jié)論:緩激肽B1R和B2R可能通過不同的信號(hào)通路發(fā)揮作用,B1R主要通過激活JNK和p38通路進(jìn)一步激活Caspase-3途徑介導(dǎo)神經(jīng)損傷作用;而B2R主要通過激活ERK1/2通路