緩激肽受體在神經(jīng)元和星型膠質細胞缺氧復氧損傷中的作用及機制.pdf

1、緩激肽(Bradykinin,BK)是由激肽釋放酶原在激肽釋放酶作用下被激活后生成的一種生物活性肽,它與其受體作用后可發(fā)揮多種生理功能,如擴張血管、降低外周血壓、抑制平滑肌增殖等。緩激肽受體在動物體內分布廣泛,幾乎存在于所有組織中,主要有B1(B1 receptor,B1R)和B2(B2receptor,B2R)兩種亞型。在生理狀態(tài)下,動物體內的緩激肽受體以B2R為主,但在應激狀況(如缺血缺氧、炎癥、外傷)下,B1R表達量明顯增高。研究

2、表明,B1R和B2R被激活后,在外周組織缺血缺氧性損傷中分別介導不同的作用,B1R激活表現(xiàn)為損傷加重,而B2R激活后表現(xiàn)為損傷減輕。本研究通過體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和星型膠質細胞,建立缺氧復氧模型,模擬在體缺血/再灌注過程,觀察緩激肽受體在缺氧復氧損傷中的變化,應用B1R和B2R的特異性激動劑和抑制劑,探討兩種受體激活后在神經(jīng)細胞缺氧復氧損傷中所介導的作用,并從信號轉導通路的角度進一步探索其作用的深層機制。
　　 目的:研究緩激肽受體

3、在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元上的表達及缺氧后不同時期表達的變化情況,是進一步探討緩激肽受體在細胞缺氧后各時期作用的前提和基礎。本文采用缺氧復氧模型,模擬體內缺血再灌注過程,缺氧90min復氧4h,觀察緩激肽受體在神經(jīng)元的表達及缺氧復氧后的變化情況。
　　 方法:采用免疫熒光雙標的方法,觀察緩激肽受體在神經(jīng)元的分布;RT-PCR檢測缺氧復氧不同時間B1R和B2R mRNA表達的變化;Western blot檢測缺氧復氧不同時間B1R和B2R

4、蛋白表達的變化。檢測的時間點為:缺氧前、缺氧90min、復氧1h、復氧4h、復氧12h、復氧24h。
　　 結果:1、在缺氧90min,復氧4h后,神經(jīng)元胞體腫脹,MAP-2免疫熒光染色顯示部分神經(jīng)元軸突呈串珠樣改變或斷裂,MTT結果表明神經(jīng)元存活率下降至正常培養(yǎng)狀態(tài)下的50％左右。2、體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存在緩激肽B1R和B2R的表達,兩者在細胞的分布存在差異,B1R主要分布于胞膜,B2R則主要分布于核膜。3、正常培養(yǎng)狀態(tài)下的神經(jīng)

5、元B1R mRNA和蛋白表達量均很低,缺氧復氧可明顯誘導B1R mRNA和蛋白的表達,復氧后1h左右達到高峰,之后迅速下降。正常培養(yǎng)狀態(tài)的神經(jīng)元有B2R mRNA和蛋白的表達,缺氧復氧使其表達量進一步增加,B2R mRNA表達水平在復氧后1h左右達到高峰,而B2R蛋白表達水平在復氧1-4h達峰,之后維持高表達。
　　 結論:1、缺氧模型有效,缺氧90min復氧4h可作為后續(xù)實驗的干預時間點。2、在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元上存在緩激肽B1

6、R和B2R的表達,兩者在細胞分布以及缺氧復氧誘導的表達變化上存在差異,這可能是其介導不同生理作用的基礎。
　　 目的:探討緩激肽B1R和B2R激活后在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元缺氧復氧損傷中所介導的作用。
　　 方法:應用緩激肽B1R和B2R特異性激動劑和抑制劑,對神經(jīng)元進行干預,運用MTT法觀察B1R和B2R被激活或抑制后神經(jīng)元存活率的變化;LDH釋放試驗觀察緩激肽B1R和B2R被激活或抑制后對神經(jīng)元細胞毒性的影響;TUNEL法

7、檢測B1R和B2R被激活或抑制后對神經(jīng)元凋亡的影響。
　　 結果:1、神經(jīng)元缺氧90min復氧4h后存活率下降至缺氧前的50％左右,LDH釋放顯著增加,凋亡百分比也增加。2、應用緩激肽B1R激動劑des-Arg9-BK能夠抑制缺氧復氧后神經(jīng)元的存活,增加神經(jīng)元的凋亡,細胞毒性作用亦增強。B1R激活對神經(jīng)元的損傷作用可被B1R瀟異性的抑制劑Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所部分抑制。3、緩激肽B2R激動劑BK可激活B2

8、R,增加缺氧復氧后神經(jīng)元存活率,減少神經(jīng)元凋亡,減輕細胞毒性作用。B2R激活后介導的神經(jīng)保護作用可被其特異性抑制劑HOE140所抑制。
　　 結論:1、缺氧復氧可引起神經(jīng)元生存率下降,LDH釋放增加,誘導神經(jīng)元凋亡。2.緩激肽B1R和B2R在神經(jīng)元缺氧復氧損傷中分別介導不同作用,B1R激活后表現(xiàn)為加重神經(jīng)元損傷,而B2R激活后可減輕缺氧復氧導致的神經(jīng)元損傷。
　　 目的:1、觀察緩激肽B1R和B2R在體外培養(yǎng)的星型膠質細

9、胞中的表達及缺氧復氧后表達的變化。2、探討緩激肽B1R和B2R激活后在體外培養(yǎng)的星型膠質細胞缺氧復氧損傷中的作用。
　　 方法:應用免疫熒光雙標法,檢測緩激肽受體在體外培養(yǎng)的星型膠質細胞上的表達。應用RT-PCR和Western blot方法,觀察星型膠質細胞缺氧復氧后緩激肽B1R和B2RmRNA及蛋白表達的變化。應用緩激肽B1R和B2R特異性激動劑和抑制劑,對星型膠質細胞進行干預,檢測B1R和B2R激活或被抑制后對缺氧復氧誘導

10、星型膠質細胞細胞因子分泌的影響。
　　 結果:1、體外培養(yǎng)的星型膠質細胞上存在緩激肽B1R和B2R的表達,與神經(jīng)元上的分布相似,B1R主要表達于胞膜,而B2R主要表達于核膜。2、正常培養(yǎng)條件下星型膠質細胞上即可以檢測到緩激肽B1R mRNA及蛋白表達,但表達量較低。缺氧復氧后B1R表達迅速上調,B1R mRNA表達在復氧后3h達到高峰,而蛋白表達在復氧后6h達峰,并持續(xù)在高水平表達。緩激肽B2R同樣表達于正常培養(yǎng)狀態(tài)下的星型膠質

11、細胞,并可被缺氧復氧誘導。在缺氧3h后,緩激肽B2RmRNA和蛋白表達水平均迅速上調,之后緩慢下降,但一直維持高于基線水平。3、缺氧復氧能誘導星型膠質細胞分泌細胞因子VEGF和GDNF。4、應用緩激肽B1R激動劑des-Arg9-BK能夠抑制缺氧復氧誘導星型膠質分泌VEGF和GDNF,這一作用可被B1R特異性的抑制劑Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所抑制。緩激肽B2R激動劑BK可增強缺氧復氧誘導星型膠質細胞分泌細胞因子VEG

12、F和GDNF,而應用B2R特異性抑制劑HOE140能夠減少其分泌。
　　 結論:1、體外培養(yǎng)的星型膠質細胞上存在B1R和B2R的表達,并可被缺氧復氧所誘導。2、缺氧復氧可使星型膠質細胞分泌VEGF和GDNF增加,緩激肽B1R激活后可抑制其分泌而B2R激活后促進其分泌。
　　 目的:應用體外培養(yǎng)的神經(jīng)元缺氧復氧模型,探討緩激肽B1R和B2R作用的信號通路及可能的機制。
　　 方法:建立神經(jīng)元缺氧復氧模型,應用ELI

13、SA方法檢測缺氧復氧所導致的神經(jīng)元上ERK1/2、JNK以及p38信號通路的激活情況。Western blot檢測緩激肽B1R和B2R特異性激動劑和抑制劑對ERK1/2、JNK以及p38信號通路磷酸化蛋白表達的影響。應用ERK1/2通路特異性抑制劑PD98059、JNK通路特異性抑制劑SP600125、p38通路特異性抑制劑SB203580,觀察上述三條通路被阻斷后緩激肽B1R和B2R在神經(jīng)元缺氧復氧后作用的變化。主要觀察指標包括:MT

14、T法測定細胞存活率,LDH法測定細胞毒性。應用分光光度法檢測Caspase-3活性,觀察緩激肽B1R和B2R激活或被抑制后對缺氧復氧誘導神經(jīng)元Caspase-3活性的影響。
　　 結果:1、缺氧后神經(jīng)元ERK1/2、JNK和p38信號通路均被激活,并隨復氧時間不同磷酸化蛋白表達水平呈現(xiàn)不同變化。ERK1/2通路在復氧1h左右磷酸化水平達到高峰,JNK通路磷酸化水平在復氧1-2h達峰而p38磷酸化水平在復氧30min后即達到高峰。

15、2、應用緩激肽B1R激動劑,可增加缺氧復氧后磷酸化JNK和p38的表達,這一作用可被其特異性抑制劑Lys-(des-Arg9-Leu8)-BK所部分抑制。應用緩激肽B2R激動劑,可增加缺氧復氧后磷酸化ERK1/2表達,抑制磷酸化JNK的表達,并且這一作用可被其特異性抑制劑HOE140所部分抑制。3、應用JNK特異性抑制劑SP600125,可抑制B1R激活后導致的神經(jīng)元LDH釋放增加,提高細胞生存率。而ERK1/2特異性抑制劑PD9805

16、9,可以抑制B2R介導的神經(jīng)保護作用,使LDH釋放增加,降低神經(jīng)元生存率。4、缺氧復氧誘導神經(jīng)元Caspase-3活性增強,B1R激動劑可使神經(jīng)元缺氧復氧后Caspase-3活性進一步增強,而應用B2R激動劑可抑制Caspase-3活性的增加。
　　 結論:緩激肽B1R和B2R可能通過不同的信號通路發(fā)揮作用,B1R主要通過激活JNK和p38通路進一步激活Caspase-3途徑介導神經(jīng)損傷作用;而B2R主要通過激活ERK1/2通路