間斷多次低溫對糖氧剝奪神經元的保護作用.pdf

1、神經保護劑的動物實驗和人類臨床試驗結果差異較大。很多神經保護劑在各種動物缺血性模型中被證明有效，但是沒有一個在人類Ⅲ期臨床試驗有作用。通過回顧性分析人類神經保護劑的隨機對照試驗(RCT)探討神經保護劑臨床轉化失敗的原因，我們發(fā)現很多因素與之相關:模型選擇，麻醉劑選擇，生理學指標監(jiān)測，造模成功標準，栓子性質，再灌注損傷，梗死面積，治療時間窗，藥物滲透性，血藥濃度，性別差異，結果評估等。而入院前“家庭藥物”超早期治療和多靶點治療或許是未來考

2、慮的方向。
　　 低溫可以通過多靶點抑制缺血后損傷通路發(fā)揮神經保護作用。頸動脈內冰鹽水灌注(ICSI)是最快速的低溫誘導方式。我們在前期工作中發(fā)現，在大鼠缺血性卒中模型中低溫的治療時間窗比血管沖洗的作用時間寬。然而持續(xù)大量的ICSI來維持局部腦低溫會導致病人一些列的副作用。因此我們考慮將這種特殊的治療方法應用于未來臨床時，我們意識到，為了在治療效果和減少持續(xù)ICSI大容量鹽水灌注的副作用方面權衡利弊，我們將其改良為間斷ICSI。

3、我們近期研究發(fā)現，與持續(xù)ICSI相比，間斷策略可以維持更長時間的低溫，對血細胞比容影響更小，可能為一種更有潛力的神經保護手段。
　　 雖然前期研究顯示間斷多次低溫對大鼠大腦中動脈梗死(MCAO)模型有治療效果。間斷低溫的神經保護機制仍不清楚。因此本實驗利用胎鼠皮層神經元糖氧剝奪模型來體外模擬缺血性卒中，利用細胞模型高通量的特點比較不同低溫模式對神經損害機制的影響，探討間斷多次低溫可能的神經保護靶點。為篩選最優(yōu)的間斷低溫模式以及未

4、來臨床應用提供理論依據。
　　 第一章皮層神經元原代培養(yǎng)
　　 胎鼠皮層神經元原代培養(yǎng)可以制作多種神經疾病的體外細胞模型。但是胎鼠腦體積較小，解剖難度相對較大，皮層神經元急性分離和培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)復雜，至今尚未有統(tǒng)一的操作路徑。因此探討一種簡便，合理，可重復性好的操作方法對于研究細胞模型至關重要。
　　 首先脫頸處死SPF級E18SD孕鼠，取出子宮和胎鼠。為了減少神經元代謝，保證其活力，接下來的解剖過程在碎冰上進行。

5、我們將傳統(tǒng)的斷頭后分離解剖頂端皮層改良為經鼻入路雙側對稱分離法進行解剖，縮短了胎鼠皮層的解剖時間。然后用體視鏡顯微剝離皮層腦膜和血管，以減少腦膜細胞和血管細胞等混雜細胞對神經元純度的干擾。由于這個過程時間較長，顯微解剖在含有10％胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺的HG-DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中進行以確保解剖過程中神經元的能量代謝。將剝離干凈的胎鼠腦皮層置入含有冰HG-DMEM（不含FBS）的一次性3.5 cm滅菌培養(yǎng)皿中，用滅菌的顯微解剖剪

6、剪碎至約1mm?？紤]到傳統(tǒng)的胰酶消化速度不好控制，我們用木瓜酶結合DNA酶Ⅰ序貫消化。終止消化后，經過巴氏管吹打和細胞篩過濾得到神經元的單細胞懸液，用0.2％錐蟲藍染色以確保細胞團塊要少于10％，死細胞數量小于1％。用0.1mg/ml左旋多聚賴氨酸預包被過的培養(yǎng)瓶以50000/cm2的密度接種神經元，4小時后發(fā)現大部分細胞已經貼壁。用neurobasal+B27+谷氨酰胺+青鏈雙抗的培養(yǎng)液換液后繼續(xù)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的神經元通過DAPI染核

7、，B-3-TUBULIN骨架蛋白免疫熒光鑒定。神經元純度通過陽性細胞計數和流式細胞儀測量均提示大于95％，可以滿足進一步實驗需要。
　　 第二章糖氧剝奪模型制作及低溫干預方案
　　 缺血性卒中發(fā)生時，血液供應減少導致病灶區(qū)營養(yǎng)和氧氣相應剝奪。這是形成“核心”梗死灶和缺血半暗帶的重要原因。而這一過程可以用體外細胞卒中模型來進行模擬。核心梗死灶中已經死亡的神經元沒有研究價值，而位于缺血半暗帶的神經元是我們體外卒中模型研究的重

8、點。越接近核心梗死灶，糖氧剝奪程度越重，而缺血半暗帶區(qū)糖氧剝奪程度相對較輕。因此我們可以通過精確控制神經元培養(yǎng)液中的“糖”等營養(yǎng)成分來模擬糖剝奪。也可以通過厭氧培養(yǎng)箱來控制神經元培養(yǎng)環(huán)境中的“氧”濃度來模擬氧剝奪。相應的，如果缺血性卒中后期，責任血管發(fā)生再通或者是側支循環(huán)建立恢復供血，又會面臨著缺血再灌注損傷。而在體外細胞模型我們可以通過重新恢復神經元培養(yǎng)液和氧供給來研究這一重要的病理生理過程。
　　 本實驗在神經元糖氧剝奪模型

9、的基礎上實施間斷多次低溫干預，具體方案為:糖剝奪用磷酸鹽緩沖液(PBS)置換培養(yǎng)液，氧剝奪用厭氧培養(yǎng)手套箱進行（氧含量小于1％），糖氧剝奪時間為90分鐘。低溫干預包括持續(xù)低溫組(CH)和間斷多次低溫組(IH)。低溫組由33℃細胞培養(yǎng)箱(Thermo，USA)中進行，常溫組設定為37℃（均為含5％CO2的細胞培養(yǎng)箱）。持續(xù)低溫1組(CH1)的低溫時長為6小時（與其他間斷多次低溫組的低溫時間之和相同）。持續(xù)低溫2組(CH2)的低溫時長為12

10、小時（與其他間斷多次低溫組的總時長相同）。間斷低溫1組(IH1)是1小時低溫間隔1小時常溫。間斷低溫2組(IH2)的低溫間斷周期為1.5小時。間斷低溫3組(IH3)的間斷周期為2小時，觀察指標的終點為低溫干預后的48小時。同時設立正常對照組與糖氧剝奪(OGD)對照組。低溫干預后我們接下來從各個角度評估其作用。
　　 第三章間斷多次低溫對糖氧剝奪神經元的保護作用
　　 本章旨在探討間斷多次低溫對糖氧剝奪后神經元可能的保護靶

11、點，以及比較持續(xù)低溫和間斷低溫對其損傷抑制作用的不同特點。本章按照第一章方法原代培養(yǎng)胎鼠皮層神經元，然后按照第二章的方法制作糖氧剝奪模型以及實施低溫干預。截至終點時觀察各項指標。首先從宏觀的角度比較各個組細胞形態(tài)學變化。然后通過神經元微環(huán)境代謝的角度，比較各組細胞活力的變化，檢測細胞損傷釋放入上清的酶標記物（神經元微管蛋白-2）以及興奮性氨基酸（谷氨酸及其氧化酶）。接下來探測細胞內氧化損傷，酸中毒，鈣超載，線粒體去極化等，探討間斷多次低

12、溫對糖氧剝奪后神經元是否具有保護作用以及其可能的機制。
　　 首先我們對各組間神經元形態(tài)學進行比較，正常組的神經元折光性強，胞體呈立體狀，軸突生長旺盛，且與周圍神經元相互聯系呈網絡狀。而OGD組的神經元密度明顯下降，神經元大量死亡漂浮導致數量明顯減少。軸突崩解，華勒變性嚴重。而OGD后低溫干預各組的神經元形態(tài)均恢復良好，僅有少量軸突斷裂，與正常對照組相比，細胞形態(tài)學變化并不明顯。由于單純從神經元形態(tài)學判斷低溫的效果并不可靠，有些

13、貌似“正?！钡纳窠浽⒂^已經發(fā)生了變化，接下來我們將從不同角度探索間斷多次低溫可能的作用。
　　 從神經元活力的角度上看，我們用Cell counting kit-8試劑盒(CCK-8)檢測各組間神經元活力，結果顯示CCK-8正常組(0.2984±0.0017)，OGD組(0.2205±0.0215), CH1組(0.2617±0.0015), CH2組(0.2535±0.0052), IH1組(0.2329±0.0026)，I

14、H2組(0.2724±0.0033)，IH3組(0.2814±0.0025)。統(tǒng)計分析后提示與正常對照組相比，糖氧剝奪后神經元活力下降。在持續(xù)低溫組中，6小時持續(xù)低溫與12小時持續(xù)低溫均有助于恢復糖氧剝奪后神經元活力，其中6小時持續(xù)低溫效果好于12小時持續(xù)低溫。在間斷低溫組中，1小時間斷低溫雖然有活力恢復的趨勢，但并未達到統(tǒng)計學意義。1.5小時和2小時間斷低溫均有助于恢復糖氧剝奪后神經元活力，其中2小時間斷低溫效果優(yōu)于1.5小時間斷低溫

15、。間斷低溫與持續(xù)低溫相比，1.5小時和2小時間斷低溫效果均優(yōu)于持續(xù)低溫組，其中2小時間斷低溫效果最佳。
　　 從神經元酶損傷標記物的角度上看，我們用大鼠神經元微管相關蛋白-2(MAP-2)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒來檢測上清中的MAP-2。結果顯示正常組(1.0780±0.1366),OGD組(1.3461±0.0966), CH1組(1.1858±0.0881),CH2組(1.2893±0.0747), IH1組(1.3

16、251±0.0616), IH2組(1.3325±0.1618),IH3組(1.1808±0.1593)。統(tǒng)計分析后提示糖氧剝奪后神經元微環(huán)境中的MAP-2含量增加。在持續(xù)低溫組中，6小時持續(xù)低溫可以抑制糖氧剝奪后MAP-2的釋放，12小時持續(xù)低溫有下降的趨勢但無統(tǒng)計學差異。在間斷低溫組中，2小時間斷低溫可以抑制糖氧剝奪后MAP-2的釋放，1小時和1.5小時間斷低溫有下降的趨勢，但未達到統(tǒng)計學意義。間斷低溫與持續(xù)低溫相比，2小時間斷低溫

17、和6小時持續(xù)低溫對減少OGD后MAP-2釋放的效果相當。
　　 從興奮性氨基酸谷氨酸及其氧化酶的角度上看，我們用Amplex(@) Red谷氨酸/谷氨酸氧化酶試劑盒檢測各組間神經元上清中谷氨酸和谷氨酸氧化酶活性。結果顯示正常組(2698.91±206.74)，OGD組(2719.35±195.53)，CH1組(2763.77±227.90), CH2組(2703.73±278.95),IH1組(2697.83±203.14),

18、IH2組(2714.32±195.63)，IH3組(2653.49±230.16)。谷氨酸氧化酶正常組(478.62±52.08)，OGD組(490.14±70.19), CH1組(494.33±92.01),CH2組(450.42±54.26),IH1組(462.52±95.59),IH2組(468.53±33.50),IH3組(455.95±46.10)。統(tǒng)計顯示，各組間數據無統(tǒng)計學差異。通過分析原因，我們發(fā)現是由于終點的設置錯過了

19、檢測時間窗所致，提示我們微透析早期動態(tài)監(jiān)測谷氨酸釋放或許更為合理。由此可見從神經元微環(huán)境代謝的角度或許不能靈敏的反應神經元內部的變化。接下來我們用熒光探針的技術探討間斷多次低溫對細胞內部靶點的影響。
　　 在此之前，我們首先要明確間斷多次低溫是否對糖氧剝奪神經元具有保護作用。我們用Hoechst33342對OGD后神經元進行定性染色，發(fā)現正常神經元核染成淡藍色，而另外有部分細胞核被染成了范圍小，藍色熒光強度高的亮點，提示確實發(fā)生

20、了凋亡。于是我們用TUNEL法定量檢測各組間神經元凋亡，結果顯示正常組為(6676.2±91.84)，OGD組(8327.6±177.19)，CH1組(7524.8±310.71),CH2組(6092.4±85.09),IH1組(4121±124.83),IH2組(7570±118.53)，IH3組(5628.20±699.82)。經統(tǒng)計分析提示，與正常對照組相比，糖氧剝奪后48小時，神經元凋亡明顯增加。在持續(xù)低溫組中，6小時持續(xù)低溫可

21、以抑制糖氧剝奪后凋亡發(fā)生，但效果不及12小時持續(xù)低溫。所有間斷低溫組均可以有效抑制神經元凋亡。其中，1小時間斷低溫的保護效果優(yōu)于1.5小時間斷低溫，但與2小時間斷低溫無統(tǒng)計學差異。間斷低溫與持續(xù)低溫組相比:1小時間斷低溫效果優(yōu)于6小時和12小時持續(xù)低溫，1.5小時間斷低溫的保護效果與6小時持續(xù)低溫相當，但不如12小時持續(xù)低溫。2小時間斷低溫效果優(yōu)于6小時持續(xù)低溫，與12小時持續(xù)低溫的保護效果相當。綜合以上結果分析提示1小時間斷低溫對糖氧

22、剝奪后神經元凋亡保護效果最佳。由此可見，間斷多次低溫確實可以減少糖氧剝奪后神經元凋亡。前期我們通過回顧性分析發(fā)現，氧化損傷，酸中毒，鈣超載，線粒體衰竭是神經元受損的主要通路。接下來我們將通過熒光探針對其相應的細胞內靶點進行檢測。
　　 活性氧的產生是氧化損傷的主要原因之一，我們用DCFH-DA熒光探針測量細胞內活性氧(ROS)發(fā)現，正常組（397.67±49.34），OGD組（1954±69.94），CH1組（424.67±21

23、.36），CH2組（395.33±33.47），IH1組（562.67±92.79），IH2組（331±26.06），IH3組（8098.33±1033.02）。統(tǒng)計分析提示，糖氧剝奪后48小時，神經元內活性氧顯著增加。在持續(xù)低溫組中，6小時持續(xù)低溫和12小時持續(xù)低溫均能抑制糖氧剝奪后神經元內活性氧產生，兩者的效果無差別。在間斷低溫組中，1小時，1.5小時間斷低溫均能抑制糖氧剝奪后活性氧產生，且二者的保護效果沒有差別。2小時間斷低溫數據

24、變異較大，謹慎起見，暫不納入分析。間斷低溫與持續(xù)低溫抑制糖氧剝奪后活性氧的效果相當。
　　 超氧陰離子自由基的產生也是氧化損傷的重要因素，我們用Dihydroethidium(DHE)熒光探針測量神經元內超氧陰離子自由基發(fā)現，正常組（69.4±3.36），OGD組（167.75±15.59），CH1組（64.2±2.28），CH2（114.4±7.54），IH1（43.6±2.30），IH2（52.8±1.79），IH3（52.

25、6±1.14）。經統(tǒng)計分析提示，糖氧剝奪后神經元內超氧陰離子自由基含量增加。在持續(xù)低溫組中，6小時和12小時持續(xù)低溫均可以抑制超氧陰離子自由基產生。在間斷低溫組中，1小時，1.5小時和2小時間斷低溫也同樣可以制糖氧剝奪后神經元內超氧陰離子自由基產生，其中1小時間斷低溫效果最好，1.5小時和2小時間斷低溫的保護效果沒有差別。間斷低溫與持續(xù)低溫相比，間斷低溫組減少OGD后超氧陰離子自由基的效果均優(yōu)于持續(xù)低溫組，其中1小時間斷低溫效果最佳。<

26、br>　　 我們用BCECF AM熒光探針，測量細胞內pH變化。其中正常組(994.2±58.87)，OGD組（67.8±24.45），CH1組(92.2±10.26)，CH2組(104.2±8.14)，IH1組（70.8±43.3），IH2組（90.0±51.87），IH3組（84.4±12.86）。統(tǒng)計分析提示，糖氧剝奪后神經元內pH水平明顯下降。持續(xù)低溫與間斷低溫雖有恢復OGD后神經元pH的趨勢，但均無統(tǒng)計學意義的改善。

27、　　 我們用FLUO-3 AM熒光探針測量細胞內游離鈣，由于同一批次胎鼠皮層神經元培養(yǎng)數量有限，為保證樣本的同質性，我們首先測量糖氧剝奪組和低溫各組的平均熒光強度。由于不同批次的神經元熒光變異非常大，不具有可比性。所以接下來利用另外一批次的神經元補充測量正常組和糖氧剝奪組。具體數據如下，OGD組(1706.8±40.3)，CH1組(2586.8±97.91)，CH2組(741.4±13.46)，IH1組(797.4±12.82)，IH

28、2組(403.8±15.61)，IH3組(688.2±13.22)。補充測量正常組(58±1.58)，OGD組(84.2±1.64)。統(tǒng)計分析提示，糖氧剝奪后神經元游離鈣含量升高。在持續(xù)低溫組中:6小時持續(xù)低溫不能降低神經元糖氧剝奪后細胞內游離鈣水平，12小時持續(xù)低溫有效。在間斷低溫組中:1小時，1.5小時和2小時間斷低溫均可以降低神經元糖氧剝奪后細胞內游離鈣水平，其中1.5小時效果最佳，2小時間斷低溫的保護效果優(yōu)于1小時間斷低溫。間斷

29、低溫與持續(xù)低溫組相比，1小時間斷低溫抑制OGD后細胞內鈣超載的效果不如12小時持續(xù)低溫，1.5小時間斷低溫和2小時間斷低溫的效果優(yōu)于12小時持續(xù)低溫，其中1.5小時間斷低溫抑制糖氧剝奪后神經元內鈣超載的效果最佳。
　　 我們用JC-1熒光探針測量線粒體膜電位變化發(fā)現，JC-1正常組(0.21±0.03)，OGD組(1.85±0.16)，CH1組(2.23±0.23)，CH2組(0.98±0.05)，IH1組(1.15±0.14)

30、，IH2組(0.61±0.14)，IH3組(0.93±0.05)。統(tǒng)計分析提示，糖氧剝奪能損害線粒體膜電位去極化。在持續(xù)低溫組中，6小時持續(xù)低溫不足矣抑制線粒體膜電位改變，12小時持續(xù)低溫有效。在間斷低溫組中，1小時，1.5小時和2小時間斷低溫均可以保護糖氧剝奪后線粒體膜電位。且它們之間的保護作用相同。間斷低溫與持續(xù)低溫組相比，1小時，1.5小時和2小時間斷低溫對糖氧剝奪后神經元線粒體膜電位改變的保護效果同12小時持續(xù)低溫效果相當。