氟非尼酮對腎纖維化炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、第一章氟非尼酮對腎纖維化炎癥反應(yīng)的影響
　　 研究背景：腎纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，其病變程度與慢性腎臟病的預(yù)后密切相關(guān)，如何防治腎間質(zhì)纖維化成為目前腎臟病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前臨床上針對抑制腎臟纖維化過程的藥物很少，尚缺乏真正有效用于臨床治療的藥物。氟非尼酮是本研究組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物，已獲得國家發(fā)明專利。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)AKF-PD可抑制成纖維細(xì)胞增殖；對單側(cè)輸尿管結(jié)扎

2、模型大鼠腎臟病變有顯著療效。AKF-PD抗腎纖維化作用的機(jī)制尚處于研究之中，目前的研究結(jié)果顯示AKF-PD能抑制NADPH氧化酶的表達(dá)和減少活性氧的產(chǎn)生，抑制腎小管細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)分化及成纖維細(xì)胞的增殖，下調(diào)致纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)，減少病變腎臟基質(zhì)膠原合成。尚未觀察AKF-PD對腎纖維化早期炎癥反應(yīng)的影響。炎癥反應(yīng)作為腎臟纖維化的始動環(huán)節(jié)之一，具有非常重要的作用，此時腎單位損傷相對較少，且并無大量肌成纖維細(xì)胞的過度增殖，經(jīng)過有效的修復(fù)，可以

3、使受損的細(xì)胞恢復(fù)自主調(diào)節(jié)功能，阻止腎病的繼續(xù)進(jìn)展。目前國內(nèi)外學(xué)者對腎纖維化炎癥反應(yīng)達(dá)成以下共識：(1)炎癥反應(yīng)是腎臟在各種損傷刺激下發(fā)生的早期事件，腎臟炎癥反應(yīng)的遷延持續(xù)，最終促使腎纖維化的形成；(2)炎癥細(xì)胞浸潤在腎臟的慢性炎癥和纖維化過程中發(fā)揮重要作用；(3)趨化因子及炎癥因子是腎纖維化形成過程中炎癥細(xì)胞浸潤和慢性炎癥持續(xù)存在的關(guān)鍵因素。
　　 針對腎纖維化的發(fā)病環(huán)節(jié)，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量抗腎纖維化藥物的研究工作，其中PFD

4、是新型的廣譜抗纖維化復(fù)合物，能夠防止甚止逆轉(zhuǎn)腎纖維化發(fā)生，但其抗腎纖維化作用機(jī)制也處于研究之中，對腎纖維化早期炎癥反應(yīng)的影響尚未有文獻(xiàn)報道；血管緊張素Ⅱ參與促進(jìn)腎臟損傷后炎癥細(xì)胞浸潤，有報道血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素受體拮抗劑(ARB)可減輕病變腎組織炎癥反應(yīng)。
　　 目的：觀察AKF-PD對UUO大鼠腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤及趨化因子、炎癥因子表達(dá)的影響；探討AKF-PD對腎纖維化炎癥反應(yīng)的影響，從而進(jìn)一步了解

5、AKF-PD抗腎纖維化的機(jī)制。
　　 方法：以單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法建立腎纖維化模型。SD大鼠（75只）隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO模型組、AKF-PD治療組、吡非尼酮治療組、氯沙坦治療組；分別于UUO術(shù)后3天、7天、14天留取各組大鼠梗阻側(cè)腎臟標(biāo)本：14天各組腎臟標(biāo)本分別行HE和MASSON染色觀察大鼠腎纖維化成模情況及藥物療效；3天、7天各組腎臟標(biāo)本分別制備石蠟切片行CD68、CD3標(biāo)記的炎癥細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，提取總RNA行re

6、al-time PCR檢測趨化因子(MCP-1，RANTES，IP-10，MIP-1α，MIP-1β)和炎癥因子(TNF-α，IL-1β)mRNA表達(dá)水平，提取總蛋白以ELISA方法檢測上述趨化因子和炎癥因子蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：(1)HE和MASSON染色結(jié)果顯示UUO術(shù)后14天模型組大鼠腎組織可見明顯間質(zhì)纖維化病理改變及大量藍(lán)染的膠原纖維，腎間質(zhì)損傷指數(shù)和腎間質(zhì)膠原相對面積評分較假手術(shù)組明顯上升，造模成功；與模型組比較

7、，AKF-PD治療組、PFD治療組及氯沙坦治療組腎組織間質(zhì)纖維化程度減輕，藍(lán)染的膠原纖維減少，腎間質(zhì)損傷指數(shù)和腎間質(zhì)膠原相對面積評分顯著下降(P＜0.05)；三種藥物作用效果相似。
　　 (2)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示UUO術(shù)后3天模型組可見巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的浸潤，術(shù)后7天浸潤的巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞增多；AKF-PD、PFD及氯沙坦均能有效抑制UUO術(shù)后3天、7天病變腎臟巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(P＜0.05)。
　　

8、(3)UUO術(shù)后3天模型組各趨化因子及炎癥因子mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高；AKF-PD治療組、PFD治療組及氯沙坦治療組各趨化因子及炎癥因子mRNA和蛋白表達(dá)水平較模型組顯著下降(P＜0.01)。且三種藥物的作用相似。
　　 UUO術(shù)后7天模型組與UUO術(shù)后3天模型組比較，趨化因子及炎癥因子的表達(dá)下降；藥物對趨化因子及炎癥因子的表達(dá)的影響有所不同：在mRNA水平，IP-10和MIP-1β組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)：

9、AKF-PD治療組RANTES、MCP-1、MIP-1α、TNF-α較模型組顯著下降(P＜0.05)；PFD治療組MCP-1、MIP-1α較模型組顯著下降(P＜0.05)；氯沙坦治療組MCP-1較模型組顯著下降(P＜0.05)，三種藥物對IL-1β作用均不明顯（與模型組比較P＞0.05）。在蛋白水平，AKF-PD治療組、PFD治療組所有趨化因子及炎癥因子較模型組顯著下降(P＜0.05)；氯沙坦治療組RANTES、MCP-1、IP-10、

10、MIP-1α較模型組顯著下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：(1)AKF-PD具有抗腎間質(zhì)纖維化的作用。
　　 (2)AKF-PD能下調(diào)病變腎臟組織趨化因子及炎癥因子的表達(dá)，從而抑制了炎癥細(xì)胞的浸潤，有效減輕病變腎臟的炎癥反應(yīng)；提示這可能是其抗腎纖維化作用的重要機(jī)制之一。
　　 (3)AKF-PD、PFD及氯沙坦減輕病變腎臟的炎癥反應(yīng)的作用相似，但對UUO術(shù)后7天大鼠腎組織各種趨化因子及炎癥因子的表達(dá)的影響有所不

11、同。
　　 第二章氟非尼酮對內(nèi)毒素血癥小鼠死亡率及炎癥因子的影響
　　 研究背景：氟非尼酮(AKF-PD)是本研究組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗腎纖維化作用。目前AKF-PD抗纖維化的機(jī)制還不十分確切，前面的研究結(jié)果顯示AKF-PD能夠下調(diào)UUO模型大鼠病變腎臟趨化因子及炎癥因子的表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤，提示抑制炎癥反應(yīng)是其抗腎纖維化作用的重要途徑之一。腎纖維化中的炎癥反應(yīng)是腎臟組織在各種損傷刺激下，

12、以單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活及炎癥介質(zhì)釋放為主的緩慢發(fā)生、持續(xù)存在的局部炎癥反應(yīng)，有別于由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥，即膿毒血癥(sepsis)。膿毒血癥的本質(zhì)是致病原激活炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，大量下游炎癥介質(zhì)基因過度表達(dá)，炎癥免疫失控和免疫紊亂。AKF-PD對其影響尚不清楚。
　　 當(dāng)微生物入侵人體，機(jī)體免疫防御系統(tǒng)會作出迅速而恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)；免疫防御能力缺陷、反應(yīng)過高或過低，都可導(dǎo)致膿毒血癥的發(fā)生和發(fā)展。臨床膿毒血癥患者最常見的是革蘭

13、陰性(G-)菌感染。革蘭陰性菌內(nèi)毒素，即脂多糖(LPS)在啟動體內(nèi)免疫系統(tǒng)反應(yīng)，導(dǎo)致中毒性休克中的重要性已得到普遍認(rèn)識。LPS介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞激活，合成和釋放各種炎癥因子（如TNF-a和IL-1β），這些炎癥因子能促進(jìn)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，激活凝血系統(tǒng)，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重者導(dǎo)致休克、多器官功能衰竭和死亡。
　　 炎癥反應(yīng)是損傷與抗損傷的統(tǒng)一過程，現(xiàn)已知機(jī)體在啟動炎癥反應(yīng)的同時，抗炎癥反應(yīng)也同時發(fā)生，產(chǎn)生抗炎性介質(zhì)等

14、。IL-10是具有抗炎和抑制機(jī)體免疫力雙重屬性的細(xì)胞因子，一方面抑制炎性細(xì)胞（如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）的粘附、浸潤，另一方面抑制各種促炎性細(xì)胞因子的合成與分泌，有助于減輕炎癥反應(yīng)。
　　 由于操作的方便性，目前常以腹腔注射LPS建立的內(nèi)毒素血癥動物模型來研究膿毒血癥的發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制，尤其是在藥物對膿毒血癥的干預(yù)與治療方面。
　　 目的：觀察AKF-PD對內(nèi)毒素血癥模型小鼠死亡率的影響，探討AKF-PD對內(nèi)毒素血癥機(jī)體的

15、保護(hù)作用；在體內(nèi)外水平觀察AKF-PD對內(nèi)毒素血癥中促炎因子(TNF-a、IL-1β)及抗炎因子(IL-10)的影響，了解AKF-PD對內(nèi)毒素血癥影響的機(jī)制。
　　 方法：以LPS(15mg/kg)腹腔注射建立小鼠內(nèi)毒素血癥模型。Balb/c小鼠（120只）隨機(jī)分為LPS模型組、AKF-PD（100mg/kg)治療組、AKF-PD(200mg/kg)治療組；AKF-PD治療組采用兩種方式給藥：AKF-PD和LPS同時腹腔注射或L

16、PS注射2小時后再予以AKF-PD腹腔注射。記錄各組小鼠第1-7天存活只數(shù)。
　　 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Balb/c小鼠（30只）隨機(jī)分為LPS模型組、AKF-PD(200mg/kg)治療組，于2h、4h、8h后摘眼球取血（每個時間點(diǎn)每組5只），4℃離心取上清，ELISA方法檢測血清中TNF-α和IL-1β濃度。
　　 獲得原代巨噬細(xì)胞，設(shè)立正常對照組(N)，LPS模型組(LPS)、AKF-PD(400μg/ml)組、AK

17、F-PD(600μg/ml)組及AKF-PD(800μg/ml)組，24小時后ELISA方法檢測各組細(xì)胞上清TNF-α、IL-1β和IL-10濃度；根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)立LPS模型組和AKF-PD(800μg/ml)組，分別于不同時間點(diǎn)）3、6、12、16、24小時）收集細(xì)胞上清，ELISA方法檢測各組TNF-α和IL-1β濃度。
　　 結(jié)果：在AKF-PD和LPS同時腹腔注射實(shí)驗(yàn)及LPS注射后2小時再予以AKF-PD腹腔注射實(shí)驗(yàn)中

18、，AKF-PD(200mg/kg)均能降低內(nèi)毒素血癥模型小鼠的死亡率(P＜0.05)，AKF-PD(100mg/kg)對內(nèi)毒素血癥模型小鼠的死亡率無明顯影響(P＞0.05)；AKF-PD在體內(nèi)外均可抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)釋放(P＜0.05)，并且呈劑量和時間依賴性；但對抗炎因子IL-10的作用不明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：AKF-PD在體內(nèi)外均可抑制促炎因子TNF-α和IL-1β的釋放，降低內(nèi)毒素血癥模