我國三峽庫區(qū)乙型腦炎病毒感染狀況調(diào)查.pdf

1、背景：
　　 流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)是通過蚊蟲叮咬感染乙腦病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的人獸共患傳染病，表現(xiàn)為急性神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀，該病主要威脅兒童。JE病死率達(dá)到30％～40％，存活者40％留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，對(duì)人類健康造成極大的威脅。全世界約有30億人生活在JE流行區(qū)，目前JE主要流行于亞洲大部分地區(qū)，我國是JE高流行區(qū)。
　　

2、 1993～2009年我國在長江流域三峽地區(qū)修建水庫，按大壩正常蓄水位175m，淹沒重慶和湖北省的19個(gè)縣市（區(qū)），造成涉及人口約1590萬人、總面積為5.6萬平方公里的三峽庫區(qū)。水庫蓄水前這一地區(qū)是JE的高流行區(qū)，并存在騷擾阿蚊、中華按蚊、三帶喙庫蚊等多種JE的傳播媒介。三峽建壩蓄水后，庫區(qū)境內(nèi)河流將改變天然急流的自然特征，水體流速減緩，自凈能力降低，加上消落區(qū)污染物滯留累積，容易為蚊蟲的孳生繁殖帶來適宜的環(huán)境。三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境發(fā)生巨

3、大的變化后，自然界JE的主要傳播媒介蚊蟲、JE中間宿主豬，以及人群的JEV感染狀況急需重新評(píng)估，以了解水庫環(huán)境變化對(duì)JE流行的潛在及中長期影響。
　　 目的：
　　 通過對(duì)三峽庫區(qū)采集的蚊蟲、仔豬血清和正常人血清標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，了解蚊蟲JEV感染率和JE中間宿主豬的JEV感染狀況，并掌握正常人群JEV中和抗體水平，為三峽庫區(qū)JE的預(yù)防控制提供病原學(xué)依據(jù)和本底資料。
　　 方法：
　　 2008～2009

4、年夏天在三峽庫區(qū)采集蚊蟲、仔豬血清和正常人血清標(biāo)本，標(biāo)本液氮保存運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。
　　 蚊蟲標(biāo)本研磨后制備cDNA文庫，采用半巢式PCR法檢測(cè)JEV基因，使用PooledInfRateManual軟件計(jì)算蚊蟲JEV感染率；同時(shí)將蚊蟲研磨液接種于組織細(xì)胞培養(yǎng)，陽性分離物使用血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。對(duì)新分離JEV的特異性基因片段擴(kuò)增測(cè)序后，使用Clusta1X1.83、MegAlign、Mega4和Genedoc3.2等生物學(xué)

5、軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析。
　　 仔豬血清標(biāo)本分別采用ELISA法和IFA法檢測(cè)IgG抗體和IgM抗體。
　　 正常人血清標(biāo)本采用蝕斑減少中和實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)JEV中和抗體。
　　 結(jié)果：
　　 1.本研究于2008～2009年連續(xù)兩年分別在三峽庫區(qū)三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)采集蚊蟲標(biāo)本，三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)自北向南依次為湖北省秭歸縣、重慶市萬州區(qū)和渝北區(qū)。兩年共采集到14183只蚊蟲標(biāo)本，分裝為286批，蚊種包括3

6、屬4種，為三帶喙庫蚊、致倦庫蚊、騷擾阿蚊和中華按蚊。三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)兩年所采集的蚊蟲種類和數(shù)量基本相同，但各地優(yōu)勢(shì)蚊種存在差異，湖北省秭歸縣以騷擾阿蚊為優(yōu)勢(shì)蚊種，占當(dāng)?shù)厮杉瘶?biāo)本的86.34％(3932/4554)，重慶市萬州區(qū)和渝北區(qū)則以三帶喙庫蚊為優(yōu)勢(shì)蚊種，分別占當(dāng)?shù)厮杉瘶?biāo)本的57.35％(2859/4985)和76.77％(3565/4644)。三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)均采集到三帶喙庫蚊，但自北向南分布存在遞增趨勢(shì)，湖北省秭歸縣、重慶市萬州區(qū)和渝北

7、區(qū)三帶喙庫蚊的構(gòu)成比分別為10.91％(497/4554)、57.35％(2859/4985)和76.77％(3565/4644)。
　　 2.2008年采集的123批蚊蟲標(biāo)本中檢出JEV核酸陽性23份，2009年采集的163批蚊蟲標(biāo)本中檢出JEV核酸陽性26份。從JEV核酸檢測(cè)陽性的蚊蟲分析可以看出三帶喙庫蚊的JEV感染率最高，也最為普遍。兩年每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)采集的三帶喙庫蚊均有JEV感染，并且自北向南呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，2008年和20

8、09年其感染率分別為39.23和31.7/1000只蚊（秭歸），10.58和3.60/1000只蚊（萬州），4.17和3.66/1000只蚊（渝北）。致倦庫蚊僅2009年在重慶市萬州區(qū)和渝北區(qū)采集到少量，其感染率分別是16.09和0/1000只蚊。中華按蚊JEV感染率也較高，但僅從2009年在湖北省秭歸縣和重慶市萬州區(qū)采集的中華按蚊中檢測(cè)到JEV，其感染率為16.32和8.22/1000只蚊。騷擾阿蚊的JEV感染率最低，2008年僅在重

9、慶市萬州區(qū)采集的騷擾阿蚊中檢測(cè)到JEV，其感染率為1.08/1000只蚊，2009年重慶市萬州區(qū)和湖北省秭歸縣采集的騷擾阿蚊JEV感染率為2.79和1.35/1000只蚊。由此可見，四種蚊蟲均有不同程度的JEV感染，其中三帶喙庫蚊JEV感染率最高，騷擾阿蚊最低。
　　 3.通過組織細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)2008～2009年采集的蚊蟲標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，結(jié)果從286批蚊蟲研磨上清中分離到22株病毒陽性分離物。血清學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，1

10、6株分離物為JEV，其中一株同時(shí)存在JEV和蓋塔病毒(Getah virus，GETV)，另外6株為GETV。基于E基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，三峽庫區(qū)分離的16株JEV均屬于基因I型，大部分分離株與2004年四川省蚊蟲標(biāo)本的JEV分離株進(jìn)化關(guān)系較近。16株JEV與JE減毒活疫苗SA14-14-2株在E基因區(qū)段存在14處共同的氨基酸差異位點(diǎn)，但決定抗原性和毒力的重要位點(diǎn)未發(fā)生變化。新分離7株GETV的3'UTR基因區(qū)段全長均為40

11、1nt，均存在GETV特有的長約53nt的3個(gè)重復(fù)序列元件和19nt的保守序列，第45～54nt間都存在與我國其它省分離株及蒙古和俄羅斯分離株一致的10nt缺失。
　　 4.為了解三峽庫區(qū)豬感染JEV的狀況，2008～2009年5月21日～6月14日在三峽庫區(qū)共采集216份仔豬血清標(biāo)本。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，兩年仔豬血清標(biāo)本JEV IgG抗體陽性率分別是48.76％(59/121)和89.47％(85/95)，IgM抗體陽性率分別

12、是46.28％(56/121)和38.95％(37/95)，提示三峽庫區(qū)仔豬JEV IgG抗體50％轉(zhuǎn)陽時(shí)間大約在5～6月。結(jié)合標(biāo)本采集時(shí)間和抗體檢測(cè)結(jié)果估算IgG抗體50％轉(zhuǎn)陽時(shí)間顯示，2009年重慶市萬州區(qū)、涪陵區(qū)和渝北區(qū)自北向南存在遞早趨勢(shì)，分別是6月9日士5日、5月23日±5日和5月16日±5日。2008年的結(jié)果此趨勢(shì)不明顯，重慶市萬州區(qū)IgG抗體50％轉(zhuǎn)陽時(shí)間比較早，可能原因?yàn)樵摫O(jiān)測(cè)點(diǎn)的仔豬飼養(yǎng)模式為豬場(chǎng)圈養(yǎng)，其他均為散戶散養(yǎng)

13、，圈養(yǎng)豬的抗體陽性率高于散養(yǎng)豬（x2=43.797，P＜0.05）。
　　 5.連續(xù)兩年在三峽庫區(qū)三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)采集正常人血清標(biāo)本，共采集1222份。湖北省興山縣、重慶市萬州區(qū)和渝北區(qū)分別采集了533份、496份和193份。2008～2009年連續(xù)兩年調(diào)查結(jié)果顯示，三峽庫區(qū)正常人血清JEV中和抗體總陽性率為71.36％(872/1222)，湖北省秭歸縣為57.04％(304/533)、重慶市萬州區(qū)為81.05％(402/496)、渝

14、北區(qū)為86.01％(166/193)。三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)自北向南JEV中和抗體陽性率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其差別部分與標(biāo)本的年齡分布有關(guān)。按年齡分組分析結(jié)果顯示，湖北省興山縣2008年標(biāo)本為大于30歲的成人，其抗體陽性率為91.18％(93/102)，2009年標(biāo)本為小于16歲的兒童，其抗體陽性率為48.91％(211/431);重慶市萬州區(qū)兩年抗體陽性率基本相同，分別為79.17％(190/240)和82.81％(212/256)，大于10歲的人群兩

15、年抗體陽性率均高于90％，小于10歲的兒童兩年抗體陽性率分別是48.89％(44/90)和53.40％(47/88)，并且隨年齡的增長呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，2008年0-、1-、5-三個(gè)年齡組的抗體陽性率分別是36.67％(11/30)、46.67％(14/30)和63.33％(19/30)，2009年結(jié)果為0％(0/22)、65.63％(21/32)和76.47％(26/34)，趨勢(shì)基本一致；重慶市渝北區(qū)兩年均以大年齡組人群為主，其抗體陽性率

16、分別是75％(72/96)和96.91％(94/97)，檢測(cè)結(jié)果基本相似。由此可見，三峽庫區(qū)兒童的JEV抗體水平低，是重點(diǎn)關(guān)注人群。
　　 結(jié)論：
　　 本研究首次在三峽庫區(qū)比較系統(tǒng)而全面地進(jìn)行了JEV傳播媒介蚊蟲，病毒擴(kuò)散的中間宿主豬，以及人群的JEV感染狀況調(diào)查。三個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)在三峽大壩自北向南依次間隔200公里，基本代表三峽庫區(qū)的地理范圍。該地區(qū)三帶喙庫蚊感染JEV最高最普遍，其次為中華按蚊，值得特別關(guān)注。該地目前JE

17、V流行株為基因I型，與SA14-14-2疫苗株存在一定的氨基酸差異位點(diǎn)，但決定抗原性和毒力的重要位點(diǎn)未發(fā)生變化，理論上目前廣泛使用的疫苗株能有效預(yù)防該病毒引起的感染。當(dāng)?shù)刈胸i自然感染JEV時(shí)間早，仔豬JEV IgG抗體50％轉(zhuǎn)陽時(shí)間大約在5～6月，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)豬抗體陽性率高于散養(yǎng)豬，有待繼續(xù)監(jiān)測(cè)和評(píng)估。三峽庫區(qū)大年齡組人群JEV中和抗體水平高，可能與多次JEV隱性感染有關(guān)，小于10歲兒童JEV中和抗體水平低，提示當(dāng)?shù)剡m齡兒童的JEV疫苗接種