N-糖基化對(duì)乙型腦炎病毒感染與免疫保護(hù)特性的研究.pdf

1、乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)是一種危害嚴(yán)重的人獸共患蟲媒傳染病,是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一。其病原體是乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV),該病毒不僅侵害人的神經(jīng)系統(tǒng),導(dǎo)致人的死亡,而且還可以引起種豬的繁殖性障礙,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。N-糖基化對(duì)乙型腦炎病毒的作用還不清楚,開展乙型腦炎病毒的N-糖基化的研究,對(duì)于揭示N-糖蛋白對(duì)該病毒感染與增殖的影

2、響,以及去N-糖基化DNA疫苗的免疫效果具有重要科學(xué)和實(shí)踐意義。本課題研究去N-糖基化修飾對(duì)乙型腦炎病毒感染和增殖的作用,還通過(guò)一系列除去N-糖基化的突變體prME和NS1蛋白免疫小白鼠,初步了解N-糖基化對(duì)免疫的重要作用。
　　 1.N-糖基化對(duì)JEV感染和增殖作用的研究
　　 用糖苷內(nèi)切酶PNGase F和Endo H處理乙型腦炎病毒,以切去乙型腦炎病毒表面的N.糖鏈,將酶切后的乙型腦炎病毒進(jìn)行Westrn blot

3、試驗(yàn)以觀察去糖基化情況,同時(shí)將糖工酶處理的JEV接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行蝕斑試驗(yàn),觀察蝕斑的大小及病毒滴度的變化情況,以研究N-糖基化在病毒侵染過(guò)程中的作用。同時(shí)用衣霉素處理BHK-21細(xì)胞并同步接種乙型腦炎病毒,進(jìn)行蝕斑試驗(yàn),觀察蝕斑大小的變化與病毒增殖情況,以研究N-糖基化在病毒增殖過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示,由Endo H和PNGase F處理的乙型腦炎病毒形成的蝕斑均顯著小于未經(jīng)處理的病毒對(duì)照,病毒增殖滴度顯著降低。衣霉素處理細(xì)胞后

4、,病毒產(chǎn)生的蝕斑大小沒(méi)有明顯差異,但增殖滴度顯著降低。通過(guò)本研究說(shuō)明,N-糖鏈對(duì)乙型腦炎病毒感染與增殖過(guò)程中均具有重要作用,切除乙型腦炎病毒表面的N-糖鏈后,乙型腦炎病毒感染能力與增殖能力顯著下降。
　　 2.N-糖基化對(duì)JEV基因免疫效果的研究
　　 用N-糖基化預(yù)測(cè)軟件,對(duì)乙型腦炎病毒的prME和NS1蛋白的基因序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)出其各有兩個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物,參考點(diǎn)突變?cè)噭┖械脑?利用PCR方

5、法進(jìn)行定點(diǎn)突變,消除乙型腦炎病毒prME和NSI基因的N-糖基化位點(diǎn),測(cè)序鑒定正確后,構(gòu)建prME和NS1基因突變的真核表達(dá)質(zhì)粒,分別為prM的第15個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的mcprME15,E的第154個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的mcprME154,prM的第15個(gè)氨基酸位點(diǎn)和E的第154個(gè)氨基酸位點(diǎn)雙突變的mcprME15154,NS1的第130個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的mc NS1130,NS1的第207個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變的mc NS1207,NS1的第1

6、30和207兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)雙突變的mcNS1130207,以及未突變的pcprME和pcNS1。對(duì)照組包括真核表達(dá)載體pcDNA3.1對(duì)照、乙型腦炎病毒SA14-14-2弱毒疫苗對(duì)照和空白對(duì)照。將上述質(zhì)粒以5μg/只劑量免疫四周齡雌性小白鼠,于首免后兩周加強(qiáng)免疫一次,一免后兩周和二免后兩周采集小鼠血液,血清進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)與中和抗體的檢測(cè),于二免后兩周對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒,做免疫保護(hù)力統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示,乙型腦炎病毒prME蛋白及其消除N-

7、糖基化位點(diǎn)的蛋白免疫小白鼠,均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生ELISA抗體、中和抗體和免疫保護(hù)力,消除單個(gè)N-糖基化的mcprME15和mcprME154與未消除糖基化pcprME刺激小鼠產(chǎn)生的抗體、中和抗體以及免疫保護(hù)力大體相同,消除兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的prME蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體、中和抗體和免疫保護(hù)力低于未突變蛋白；NS1蛋白及其消除N-糖基化位點(diǎn)蛋白的能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力,消除單個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的NS1蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的保護(hù)率高達(dá)到1