不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)日本乙型腦炎病毒感染的影響.pdf

1、日本乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染引起的神經(jīng)性疾病。該病主要分布在南亞和東南亞地區(qū)，現(xiàn)已成為該地區(qū)主要流行的病毒性腦炎。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，JEV感染每年可導(dǎo)致約10000-15000人死亡。但并不是所有的JEV感染都能夠引起發(fā)病，僅有少數(shù)（大約1:300）感染的個(gè)體表現(xiàn)腦炎的癥狀。因此，這些腦炎的病例說(shuō)明，在從外周擴(kuò)散入腦的過(guò)程中，JEV可通過(guò)某種機(jī)制逃逸宿主

2、的免疫監(jiān)視。已有的研究顯示，外周血單核細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞及其前體細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮一定的作用，表現(xiàn)為：
　　1）可以從外周單核細(xì)胞中分離獲得JEV；
　　2）JEV可以在巨噬細(xì)胞中存活。所以，從某種意義上講，JEV與巨噬細(xì)胞相互作用很可能會(huì)影響JE的發(fā)生。
　　巨噬細(xì)胞是機(jī)體的主要免疫細(xì)胞，在宿主的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)中都起著重要的作用。其生物學(xué)功能因激活狀態(tài)不同而受到影響，目前，巨噬細(xì)胞根據(jù)激活狀態(tài)主要分為M1

3、型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，前者主要由Th1型細(xì)胞因子如γ-干擾素（Interferon-γ,IFN-γ）等誘導(dǎo)產(chǎn)生，后者主要由Th2型細(xì)胞因子如IL-4（Interleukin-4）等誘導(dǎo)產(chǎn)生。體外的研究顯示，相對(duì)于非免疫細(xì)胞如Vero細(xì)胞(Verda Reno,非洲綠猴腎細(xì)胞)、MEF(Mouse Embryonic Fibroblast,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)等，巨噬細(xì)胞顯示出明顯的抑制 JEV作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ誘導(dǎo)的

4、巨噬細(xì)胞可以通過(guò)促進(jìn)一氧化氮（nitrogen monoxidum,NO）的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制。但是，目前對(duì)M2型巨噬細(xì)胞是如何影響JEV感染的機(jī)制還不清楚。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)Th2免疫反應(yīng)對(duì)JEV引起的腦炎具有保護(hù)作用。
　　目的：
　　為了闡明不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，尤其是對(duì)JEV強(qiáng)毒株感染的影響，有以下2個(gè)研究目的，
　?。?）明確JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體內(nèi)和體外的感染特性；
　?。?/p>

5、2）解析不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJ2008感染的影響。
　　方法：
　?。?）為了明確JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體內(nèi)和體外的感染特性，首先，用C6/36細(xì)胞增殖NJ2008，并通過(guò)TCID50測(cè)定分析病毒滴度。其次，通過(guò)腹腔感染C57BL/6小鼠測(cè)定生存曲線。隨后，利用TCID50測(cè)定、Western Blot以及間接免疫熒光法對(duì)JEV腦部感染情況進(jìn)行分析。最后，對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體外的感染特性進(jìn)行了

6、分析，包括：
　　1）利用TCID50測(cè)定分析比較了NJ2008在BHK-21和巨噬細(xì)胞RAW264.7上的一步生長(zhǎng)曲線；
　　2）利用間接免疫熒光法分析比較了NJ2008在以上兩種細(xì)胞上的感染情況。
　　（2）為了解析不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJ2008感染的影響，首先，利用細(xì)胞因子（IL-4或 IFN-γ）處理 RAW264.7細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志分子（iNOS和Arg-1）以

7、及細(xì)胞因子（CXCL-10和TNF-α）的變化情況，確定巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)；然后通過(guò)TCID50、免疫熒光技術(shù)和熒光定量PCR方法比較JEV強(qiáng)毒株NJ2008在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的感染情況。
　　結(jié)果：
　?。?）JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體內(nèi)和體外的感染特性分析：首先，利用TCID50測(cè)定對(duì)增殖的病毒進(jìn)行分析，計(jì)算獲得病毒的滴度為8.3×108 TCID50/0.1 mL。其次，通過(guò)腹腔感染C57BL/6小鼠測(cè)定生存

8、曲線，發(fā)現(xiàn)以8.3×104 TCID50/100μL/小鼠進(jìn)行感染，于感染后7天到14天死亡率超過(guò)60％。隨后，對(duì)發(fā)病小鼠腦的感染情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)的病毒滴度超過(guò)107 TCID50/腦，進(jìn)一步，Western Blot以及間接免疫熒光法（IFA）分析顯示腦內(nèi)JEV感染陽(yáng)性。最后，對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體外的感染特性進(jìn)行了分析，一步生長(zhǎng)曲線的結(jié)果顯示于感染后24小時(shí)病毒的滴度達(dá)到高峰，然而，相對(duì)于 BHK-21中的感染情況，

9、JEV在RAW264.7中的感染顯著降低，進(jìn)一步的 IFA檢測(cè)結(jié)果顯示JEV在BHK-21中的感染率明顯高于在RAW264.7中的感染率。
　?。?）不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV強(qiáng)毒株NJ2008感染的影響：首先，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于PBS處理組，IFN-γ處理組顯著上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志分子iNOS，同時(shí)顯著上調(diào)CXCL-10和TNF-α的表達(dá)，說(shuō)明成功將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞；另外，相對(duì)于PBS

10、處理組，IL-4處理組顯著上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志分子Arg-1，同時(shí)抑制炎性因子CXCL-10和TNF-α的表達(dá)，說(shuō)明成功將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞；其次，我們利用上述細(xì)胞對(duì)JEV感染情況進(jìn)行了分析，雖然JEV在M2型巨噬細(xì)胞上的感染與PBS組沒(méi)有明顯的變化，但是，其在M1型巨噬細(xì)胞上的感染顯著受到了抑制。因此，以上結(jié)果明確了不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的影響，并顯示NO的上調(diào)表達(dá)在M1型巨噬細(xì)胞抑制JEV感染中起著主導(dǎo)作

11、用。
　　結(jié)論：
　　我們的研究明確了M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞對(duì)JEV感染的作用。進(jìn)一步研究顯示，M1型巨噬細(xì)胞可顯著地抑制JEV的感染，即通過(guò)促進(jìn)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制。雖然M2型巨噬細(xì)胞在抑制JEV感染方面不如M1型巨噬細(xì)胞明顯，但是，在JEV腦內(nèi)感染中，Th2免疫反應(yīng)對(duì)JEV腦內(nèi)感染具有保護(hù)作用。M2型巨噬細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中是否發(fā)揮了重要作用，尚不清楚，這些疑問(wèn)將在今后的研究中進(jìn)行探討?？傊?，我們的結(jié)果明確了不