中國人內(nèi)皮抑素-血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子融合基因治療胃癌的實驗研究.pdf

1、主要研究內(nèi)容、方法和結(jié)果如下:1、攜帶內(nèi)皮抑素-血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子融合基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及重組腺病毒制備;設計引物用PCR方法從pBV220-hEndosatin中擴增hENDO基因,在其5'端引入HindⅢ酶切位點和IL<,3>信號肽序列,3'端引入編碼纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸(Val-Pro-Gly-Val-Gly)五個氨基酸的彈性蛋白連接肽(linker)序列和EocR I酶切位點,得到647bp的IL<

2、,3>/hENDO-linker片段;用PCR方法從pUC18-VEGI<,151>擴增VEGI<,151>片段在其5'端引入EocR I酶切位點,3'端引入BamH I酶切位點得到476bp的linker-VEGI<,151>片段.產(chǎn)物經(jīng)純化后,分別克隆到pMD18-T載體,經(jīng)DNA自動測序證明序列正確.腺病毒載體pCA13用HindⅢ和BamH I雙酶切線性化,用HindⅢ/EocR I將IL<,3>/hENDO-linker片段從

3、攜帶目的基因的pMD18-T載體上游離下來,用EocR I/BamH I將linker-VEGI<,151>片段從攜帶目的基因的pMD18-T載體上游離下來,在T<,4>DNA連接酶作用下,將線性化的pCA13與HindⅢ-EocR I IL<,3>/hENDO-linker片段和EocR I-BamH I linker-VEGI<,151>片段進行連接,構(gòu)建成pCA13 IL<,3>/hENDO-linker-VEGI<,151>,酶

4、切鑒定連接和閱讀框正確.將pCA13 IL<,3>/hENDO-linker-VEGI<,151>與含有5型腺病毒大片段的質(zhì)粒pJM17,用LipofectAMINE介導共轉(zhuǎn)染293細胞,約10天包裝出重組腺病毒,經(jīng)過篩選及PCR鑒定證實重組腺病毒攜帶融合基因,包裝好的腺病毒命名為:Ad IL<,3>/hENDO-VEGI<,151>.同法制備攜帶報告基因LacZ重組腺病毒AdLac-Z.大量擴增病毒,經(jīng)氯化銫梯度離心純化獲得1.1×1

5、0<'10>puf/ml滴度的重組腺病毒.2、融合基因在體外的表達與鑒定及攜帶融合基因重組腺病毒對胃癌細胞和血管內(nèi)皮細胞增殖及生物學特性影響的體外研究.3、融合基因在活體內(nèi)的表達與鑒定及攜帶融合基因重組腺病毒治療胃癌的體內(nèi)實驗研究.該研究雖證實了重組腺病毒攜帶的融合基因可在體內(nèi)外表達,并證實了其在體外抑制內(nèi)皮細胞增殖,促進凋亡;體內(nèi)抑制腫瘤生長的肯定結(jié)果.但動物實驗結(jié)果表明種植瘤的生長僅僅被減慢,而與國外學者報告的使腫瘤消退到顯微狀態(tài)的