小鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞導(dǎo)向自殺-內(nèi)皮抑素基因治療肝癌的研究.pdf

1、第一部分CD和ES基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:分別構(gòu)建攜帶胞嘧啶脫氨酶（Cytosine Deaminase，CD）和血管內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)基因的慢病毒載體，為進(jìn)一步進(jìn)行CD、ES基因治療肝癌奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:根據(jù)GeneBank提供的大腸桿菌源CD和ES基因序列設(shè)計(jì)、合成兩個(gè)基因并構(gòu)建與熒光蛋白融合的真核表達(dá)載體pEGFP-CD和pDS-RED-ES。酶切和測(cè)序鑒定后，將載體瞬

2、時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。運(yùn)用Real-Time PCR檢測(cè)CD和ES基因表達(dá)情況。把載體中基因片段EGFP-CD和DS-RED-ES通過BP/LR重組分別構(gòu)建慢病毒載體，并利用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝;將病毒原液濃縮，并測(cè)定病毒滴度。
　　 結(jié)果:酶切和測(cè)序、PCR鑒定證實(shí)構(gòu)建出了慢病毒載體pLenti6.3-CD-EGFP和pLenti6.3-ES-Monomer-DsRed，感染293T細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察到GFP和D

3、sRed的表達(dá)，濃縮慢病毒滴度分別為2.2*108TU/ml和6.5*107TU/ml。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了CD和ES基因慢病毒表達(dá)載體。
　　 第二部分小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及7.0T磁共振成像研究
　　 目的:應(yīng)用納米磁粒子Resovist體外標(biāo)記小鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，磁共振(MR)對(duì)標(biāo)記細(xì)胞成像。
　　 方法:分離小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。免疫熒光及qPCR

4、檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)記CD31、KDR、vWF表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)內(nèi)吞Di I標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(Di I—AcLDL)和結(jié)合F I T C標(biāo)記的荊豆凝集素(—)1(FITC—UEA—1)的功能，觀察細(xì)胞體外基質(zhì)膠中成管情況。Resovist體外標(biāo)記EPCs，普魯士藍(lán)染色顯示細(xì)胞內(nèi)鐵。利用7.OT MR進(jìn)行快速小角度激發(fā)(Fast Low Angle Shot，F(xiàn)lash)2D-FLASH序列和多自旋回波序列(multislice，mu

5、ltiecho，MSME)及不同數(shù)量級(jí)標(biāo)記細(xì)胞群成像。
　　 結(jié)果:免疫熒光及qPCR顯示培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31、KDR、vWF，能結(jié)合UEA、內(nèi)吞LDL，體外基質(zhì)膠上可以形成管狀結(jié)構(gòu)。Resovist細(xì)胞標(biāo)記率接近100％，普魯士藍(lán)染色鐵染細(xì)胞胞漿為藍(lán)色、胞核為紅色。MRI顯示標(biāo)記Resovist的細(xì)胞群較未標(biāo)記者T2*梯度回波序列信號(hào)降低，2D-FLASH序列較MSME序列對(duì)單細(xì)胞成像檢測(cè)更敏感。
　　 結(jié)

6、論:小鼠骨髓源單個(gè)核細(xì)胞體外可以誘導(dǎo)培養(yǎng)為內(nèi)皮祖細(xì)胞，Resovist能成功標(biāo)記EPCs，利用MR可以對(duì)標(biāo)記細(xì)胞群成像，可用于進(jìn)一步細(xì)胞治療及實(shí)時(shí)活體監(jiān)測(cè)。
　　 第三部分小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞導(dǎo)向自殺/內(nèi)皮抑素基因治療肝癌的研究
　　 目的:細(xì)胞法制作小鼠肝癌模型，慢病毒載體Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性EPCs，SPIO標(biāo)記后回輸肝癌小鼠。探討

7、內(nèi)皮祖細(xì)胞導(dǎo)向自殺/內(nèi)皮抑素基因治療肝癌的可行性。
　　 方法:體外培養(yǎng)、擴(kuò)增小鼠骨髓源性EPCs，慢病毒載體Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed轉(zhuǎn)染、SPIO標(biāo)記EPCs。觀察體外基質(zhì)膠上細(xì)胞成管功能、Millicell細(xì)胞遷移小室中細(xì)胞遷移能力、CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞H22增殖能力影響。細(xì)胞法制作小鼠肝癌模型，尾靜脈注射DID標(biāo)記EPCs至肝癌小鼠及正常

8、小鼠后不同時(shí)間對(duì)離體組織進(jìn)行光學(xué)成像觀察EPCs體內(nèi)遷移情況。尾靜脈注射負(fù)載自殺/內(nèi)皮抑素基因的EPCs至肝癌模型鼠。實(shí)驗(yàn)分為5組:第1組為移植EPCs+SPIO+LV組，第2組為移植EPCs+SPIO+CD/5-FC組、第3組為EPCs+SPIO+ES組、第4組EPCs+SPIO+CD+ES組和第5組EPCs+SPIO+CD/5-FC+ES組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在移植前及移植后7d、14d、21d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取2只進(jìn)行MR掃描，根據(jù)MR圖

9、像繪制腫瘤生長曲線;進(jìn)行組織病理學(xué)分析、生存分析。
　　 結(jié)果:慢病毒載體Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性EPCs后熒光顯微鏡下分別可見細(xì)胞呈綠色、紅色熒光，共轉(zhuǎn)染后為橙色熒光。EPC+CD+ES組在體外基質(zhì)膠上成管數(shù)及遷移小室中細(xì)胞遷移數(shù)量均明顯少于EPC組; EPC+SPIO+CD/5-Fc+ES組細(xì)胞上清較EPC及EPC+SPIO+LV組上清液對(duì)小鼠肝癌細(xì)

10、胞H22體外增殖具有明顯抑制作用。DID標(biāo)記EPCs后光學(xué)成像顯示EPCs尾靜脈注射后短期內(nèi)主要分布于肝，少量依次分布于脾、腎、肺等組織。5組細(xì)胞分別通過尾靜脈回輸肝癌小鼠后，EPC+SPIO+CD/5-Fc+ES組較EPC+SPIO+LV組及其他治療組小鼠肝癌腫瘤體積小、增長速度慢，中位生存期延長;腫瘤組織內(nèi)CD31陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于EPC+SPIO+LV組、凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于EPC+SPIO+LV組。
　　 結(jié)論:負(fù)載C