雞柔嫩艾美耳球蟲表面抗原SAG2和SAG7基因的克隆與表達.pdf

1、雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)的重要寄生蟲病，目前仍主要依賴各種抗球蟲藥物防治。近年來，由于球蟲抗藥性的產(chǎn)生和人們對綠色環(huán)保食品的呼喚，人們開始研究其它可持續(xù)的防治技術(shù)。從長遠觀點出發(fā)，基因工程苗和/或核酸疫苗是最終控制雞球蟲病的必然選擇，而雞球蟲保護性抗原基因的篩選是研制基因工程苗及核酸疫苗研究的基礎(chǔ)。入侵相關(guān)蛋白是目前研究較多的球蟲抗原，主要包括子孢子/裂殖子表面蛋白、以及微線、棒狀體、折光體等分泌型亞細胞器抗原。Tomley等(20

2、04)分析了來自E.tenella的子孢子和第二代裂殖子的EST序列，得到了潛在的具有GPI錨定結(jié)構(gòu)域的表面抗原的mRNA序列，研究表明只有一種特定的EtSAGs在子孢子上表達，小部分在兩個階段都有表達，而大部分主要在第二代裂殖子上表達。本研究在國內(nèi)首先進行了雞柔嫩艾美耳球蟲表面抗原SAG2、SAG7基因的克隆與原核表達，以為進一步研究其免疫原性及其它生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 (1)根據(jù)GenBank已報道(Tomley等，2005

3、)的E.tenella豪頓株表面抗原SAG2、SAG7mRNA基因序列設(shè)計特異性引物，用RT-PCR方法克隆了E.tenella楊陵株SAG2、SAG7基因，與豪頓株相比，核甘酸序列的同源性高達99％，推導(dǎo)的氨基酸序列相似性達99％，這說明SAG2、SAG7基因在不同地理株之間有很高的保守性，而他們與宿主細胞之間的相互作用關(guān)系以及是否具有一定免疫原性，有待進一步試驗證明。同時應(yīng)用3'-末端快速擴增法(3'-RACE)獲得SAG2/SAG

4、7基因的3'-末端非翻譯區(qū)，測序表明具有真核生物mRNA基因3'-末端序列的特征，證明擴增獲得SAG2/SAG7基因的3'-末端序列。 (2)擴增了不含N端疏水性信號肽序列SAG2、SAG7基因，并將其克隆至表達載體pET-32a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，實現(xiàn)其在宿主菌BL21(DE3)中表達，誘導(dǎo)4h后表達量最高，重組蛋白占菌體總蛋白的50％。經(jīng)SDS-PAGE分析融合蛋白大小分別約為47ku、45ku