剛地弓形蟲SAG2基因的克隆、表達(dá)與ELISA方法的建立.pdf

1、膜表面蛋白2（the surface antigen 2，SAG2）是弓形蟲速殖子表面的重要抗原，對(duì)弓形蟲的預(yù)防和檢測具有重要意義。 本文將剛地弓形蟲RH株SAG2基因分別連接到pPIC9K、pGEX-4T-2、pET28b質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-SAG2、pGEX-4T-SAG2、pET28b-SAG2。然后分別轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115和E.coli BL21(DE)中進(jìn)行表達(dá)，得到15kD、41kD、20kD左右蛋

2、白。經(jīng)SDS-PAGE比較，pGEX-4T-SAG2重組質(zhì)粒得到的重組蛋白GST-SAG2產(chǎn)量最高。用AKTA purifer系統(tǒng)和GSTrap FF柱對(duì)GST-SAG2蛋白進(jìn)行純化，Western-blotting表明該蛋白能與兔感染弓形蟲陽性血清特異性結(jié)合。單因素改變表達(dá)條件試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基2×YTA，IPTG濃度0.1mM，誘導(dǎo)時(shí)間3h，培養(yǎng)溫度30℃，搖瓶轉(zhuǎn)速220rpm為最佳表達(dá)條件，表達(dá)蛋白可達(dá)總體蛋白的25％以上。

3、 用目的蛋白為抗原，對(duì)ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。確定最佳抗原包被比例為1:100（0.25μg/ml）、最佳血清稀釋比例為1:200、最佳酶標(biāo)二抗稀釋比例為1:2000。根據(jù)已經(jīng)建立的ELISA方法與反應(yīng)條件，確定陰陽性臨界值為0.214。用本方法和珠海?？瞪锏脑噭┖泄餐瑱z測20份已知弓形蟲陰陽性血清，陰陽性符合率皆為100％。交叉試驗(yàn)表明ELISA法具有良好的特異性。上述研究建立了一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法，為弓形蟲的檢測調(diào)查提