柔嫩艾美耳球蟲抗原基因TA4和EtMIC-,4-的克隆與原核表達載體的構建.pdf

1、TA4基因是柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)孢子化卵囊的一個表面抗原基因，其表達的蛋白具有一定的免疫原性；EtMIC4是編碼E.tenella細胞器微線蛋白的基因，在子孢子及裂殖子階段表達，分泌的蛋白向后覆蓋于蟲體的表面，與宿主細胞表面相黏附，參與蟲體的運動及入侵。本文以TA4基因和與球蟲入侵宿主細胞有關的EtMIC4部分基因作為研究目標，根據Genbank中登錄的序列設計引物，利用RT-PCR技術從E.tenella(上海株)孢子

2、化卵囊中擴增出TA4基因和EtMIC4基因的一部分。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，將大小與TA4基因預計分子量一致的片段純化后連接到pGEM-T-easy克隆載體中，再轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，得到的轉化子經PCR鑒定和酶切分析篩選陽性克隆；將大小與EtMIC4基因片段預計分子量一致的片段純化并經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切回收后，與經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切回收的pET-28-a和pET-32-a表達載體連接。結果表明：①得到了含有

3、TA4基因的陽性重組子(pGEM-TA4)，經核苷酸測序，該序列全長773bp，其中TA4基因的閱讀框為651bp，編碼216個氨基酸，與國外報道的TA4基因(登錄號：M21004.1)比較，序列的同源性為100﹪(773/773)。與國內報道的TA4(浙江株)基因(登錄號：DQ327836.1)比較，序列的同源性為99﹪(765/770)，即在TA4(浙江株)基因序列的38bp、51bp、229bp、462bp和635bp處的堿基分別

4、是G、A、G、T、T而TA4(上海株)的則是A、C、A、A、C，其中51bp和229bp處堿基不同，其翻譯后相應的氨基酸也不同，在浙江株是Met和Arg，而在上海株則是Leu和Lys，其它氨基酸相同；②得到了含有EtMIC4基因片段的陽性重組子(pET-28-a-EtMIC4和pET-32-a-EtMIC4)，經核苷酸測序，該基因序列全長1351bp，其中基因的閱讀框為948bp，編碼315個氨基酸，該序列與Tomley[6]等發(fā)表的序

5、列(登錄號：AJ306453.1)進行網上比對后發(fā)現：兩者之間有99﹪(1138/1140)的同源性，即在EtMIC4(登錄號：AJ306453.1)序列的6061bp和6126bp處的堿基分別為T和G，而在EtMIC4(上海株)則是C和A；此外在EtMIC4(登錄號：AJ306453.1)序列的5510bp處比其多125個堿基，但多的堿基位于基因的閱讀框之外；與杜愛芳等[60]發(fā)表的5401基因序列(登錄號：AY819649.1)有9

6、9﹪(861/864)同源性；推測這種堿基不同的現象，可能是由于E.tenella不同地理株之間存在一定的遺傳差異所導致的。將經測序為正確的重組克隆質粒(pGEM-TA4)用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切并回收后，與經EcoRl和HindⅢ雙酶切回收的pET-28-c相連接；用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切并回收后，與經EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切回收的pGEX-4T-2相連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，得到的轉化子經PCR鑒定和酶切分析