弓形蟲SAG2基因的測序、檢測及表達.pdf

1、弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生的原蟲，引起人獸共患的弓形蟲病，可以通過肉食品感染人及動物。建立靈敏的、快速的PCR檢測方法是必須的。該實驗進行了三方面的研究。 1.建立豬弓形蟲Nested-PCR檢測方法，弓形蟲基因組SAG2基因片斷設計并合成兩對引物，建立快速、準確、靈敏的Nested-PCR檢測豬弓形蟲的方法。靈敏度試驗結果可檢測到每克肉10<'2>個弓形蟲基因組DNA水平；對新孢子蟲、隱孢子蟲、柔嫩艾美耳球蟲、豬肉孢子蟲牛球蟲

2、、伊氏錐蟲等種病原生物檢測，結果均為陰性，表明此方法特異性強。將采自獸醫(yī)院門診及屠宰場的68份豬血清樣品分別用Nested-PCR和PAPS進行平行檢測。PAPS初步檢測68份樣品，陽性及可疑的血清樣品共計17份，PCR檢測出陽性樣品16份。結論認為，巢式PCR方法可用于弓形蟲早期感染的檢測，具有敏感性高、特異性強、穩(wěn)定性好的特點。 2.弓形蟲上海株DNA為模板，采用PCR方法擴增SAG2基因，通過與pGEM T-Easy ve

3、ctor連接、轉(zhuǎn)化JMl09、克隆、測序，得上海株弓形蟲SAG2基因序列與RH株高度相似。 3.SAG2-pGEM T-Easy vector為模板，擴增編碼主要表面抗原P22的基因片段。將該基因片段播入T/A克隆，引入酶切位點，雙酶切、純化目的片段與PGEX-6p-1按一定比例T4連接。用PCR結合雙酶切的方法鑒定，核酸測序驗證，將構建好的原核表達載體eP22-pGEX-6P-1轉(zhuǎn)入表達菌株BL21中，用1mmol/L IPT