DSS所致的慢性實驗性結腸炎加重CCl4誘導的肝纖維化及其機制研究.pdf

1、肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)是肝臟對病毒、酒精、代謝毒物等各種致病因子所致的組織修復反應。肝纖維化是可逆的，而肝硬化卻難以逆轉。因此研究肝纖維化的發(fā)病機制并盡早干預對阻止疾病進展甚或逆轉肝纖維化具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥可加重高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎，因此腸黏膜屏障受損可能在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。
　　在炎癥性腸病(inflammotoryboweldisease，IBD)的研究中

2、發(fā)現(xiàn)，肝膽系統(tǒng)病變是其最常見的腸外表現(xiàn)之一。IBD發(fā)病時，腸黏膜屏障功能受損，引起腸道菌群失調，繼發(fā)細菌移位，導致內毒素血癥，進而引起肝損傷。Marshall于1998年正式提出了“腸-肝軸”的概念，指出腸道和肝臟在對機體免疫防御功能上是相互影響，相互調節(jié)，密不可分的。腸黏膜屏障功能受損，腸道菌群，內毒素進入門脈系統(tǒng)進而誘發(fā)肝臟疾病。此外，肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎等肝臟疾病常伴有腸源性內毒素血癥(intestinalendotoxe

3、mia，IETM)，這可能與肝病時腸道內毒素吸收增多有關。
　　肝星狀細胞(hepaticstellatecells，HSCs)的活化增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)?；罨腍SCs分泌大量趨化因子，引起肝巨噬細胞(Kupffercell，KCs)聚集到損傷部位產(chǎn)生大量TGF-β。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活星狀細胞表面的Toll樣受體4(Tolllikereceptor4，TLR4)通過MyD-88-N

4、F-κB途徑下調TGF-β誘導受體，增強TGF-β信號轉導通路促進纖維化的發(fā)生。
　　LPS是革蘭氏陰性細菌內毒素的重要成分，細菌裂解或黏附在其他細胞上時得以釋放。TLR是識別病原微生物的主要受體，其中，TLR4在人體免疫中發(fā)揮重要作用。TLR4是LPS信號導入細胞內的表面受體，當與LPS結合后，TLR4通過其胞漿域募集銜接蛋白MyD-88(Myeloiddifferentiationprotein88)，進一步作用于其下游分子T

5、NF-α受體活化的因子6(tumornecrosisreceptor-associatedfactor,TRAF6)，隨后引起NF-κB的活化，導致大量促炎癥細胞因子的產(chǎn)生從而介導肝臟病變。GabeleE等的研究，表明非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)伴有腸道炎癥，會明顯促進肝臟病變，證實結腸炎癥可能通過“腸-肝軸”介導肝臟病變。為此，我們聯(lián)合腹腔注射CCl4與飲用DSS誘導建立了小鼠

6、肝纖維化伴腸道損傷模型，來研究結腸炎癥對肝臟炎癥和纖維化病變的影響;同時觀察慢性實驗性結腸炎相關的肝臟病變情況，并探討內毒素及腸肝軸在其中的作用，從而為延緩肝纖維化的進展以及IBD的綜合治療提供理論依據(jù)。
　　目的:研究DSS所致的慢性實驗性結腸炎加重CCl4誘導的肝纖維化的機制。
　　方法:將50只雄性C57BL/6小鼠按完全隨機法分為conrtol組（正常飲食），DSS組(間斷飲用2％DSS)，Oliveoil組（腹腔注

7、射橄欖油10μL/g，每周2次），CCl4組（腹腔注射5％CCl4橄欖油10μL/g，每周2次）和CCl4+DSS組(間斷飲用2％DSS聯(lián)合腹腔注射5％CCl4橄欖油10μL/g)，每組10只。結腸黏膜炎癥程度的評估包括疾病活動指數(shù)(Diseaseactivityindex，DAI)、結腸形態(tài)學變化和組織病理學評分，檢測結腸組織中MPO的含量;測定血清LPS水平及細菌移位率;分別應用免疫組織化學染色、Westernblot技術和real

8、-timePCR技術檢測結腸組織中TNF-α，IFN-γ，IL-17A，緊密連接蛋白occludin，claudin-1的表達水平;應用Haematoxylin&eosinstaining(H&E染色)、Masson'strichromestaining(MT染色)、Siriusredstaining（天狼猩紅染色）等方法觀察肝臟病理學改變;分別采用免疫組織化學染色、westernblot和real-timeQ-PCR方法檢測各組小鼠肝

9、臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原、MMP-2、TIMP-2、TLR4、TRAF6和NF-κB的表達水平。
　　結果:①與對照組相比，DSS組和CCl4+DSS組小鼠體重顯著減輕，DAI顯著升高，結腸壁充血、水腫、長度顯著縮短，結腸組織病理切片示大量炎癥細胞浸潤，黏膜上皮破壞形成淺潰瘍，病理評分顯著增加;MPO活性顯著升高;免疫組織化學檢測、Westernblot和real-tim

10、eQ-PCR檢測結果顯示TNF-α、IFN-γ和IL-17A表達水平顯著升高（P＜0.05）;而這兩組之間沒有明顯差異(P＞0.05);②肝臟組織H&E顯示:DSS組可見肝內匯管區(qū)炎癥細胞浸潤增加，肝細胞排列散亂，肝細胞水腫、胞漿疏松化;CCl4組及CCl4+DSS組均可見到肝臟組織肝板排列紊亂，肝細胞水腫、胞漿疏松化，可見肝細胞空泡樣變性，大量肝細胞變性壞死，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤，尤以CCl4+DSS組顯著;炎癥評分結果顯示:DSS

11、組、CCl4組、CCl4+DSS組均顯著高于對照組，尤以重疊組升高明顯;差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;③肝臟組織MT染色、天狼猩紅染色顯示，DSS組可見肝小葉中央靜脈壁纖維染色，匯管區(qū)及小葉間隔內少許纖維組織沉積，較對照組無明顯變化;CCl4組及CCl4+DSS組均可見到肝小葉結構紊亂，增生小膽管周圍纖維組織生成，中央靜脈周圍及匯管區(qū)可見纖維組織沉積增多，肝纖維化形成但是此種病變尤以CCl4+DSS組病變嚴重;纖維化程度分級顯示:

12、DSS組較正常對照組小鼠相差不大（P＞0.05），CCl4組、CCl4+DSS組肝臟纖維化程度分級顯著高，尤以重疊組升高顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;④羥脯氨酸測試盒檢測結果顯示，同正常對照組相比，DSS組小鼠羥脯氨酸含量略升高，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);CCl4組小鼠和CCl4+DSS組小鼠羥脯氨酸含量明顯升高，CCl4+DSS組含量顯著高于單純CCl4組小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;⑤血清肝功能檢測顯

13、示，同正常對照組相比，DSS組小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartateaminotransferase，AST)水平明顯升高，白蛋白(albumin，ALB)水平明顯減少（P＜0.05），血清總膽紅素(totalbilirubin，TBIL)、直接膽紅素(directbilirubin，DBIL)水平相差不大(P＞0.05);CCl4組和CCl4+DSS

14、組小鼠ALT、AST、TBIL及DBIL水平明顯增高，ALB水平明顯下降，CCl4+DSS組變化較單純CCl4組小鼠顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;⑥免疫組織化學染色、Westernblot和real-timeQ-PCR檢測肝臟中TNF-α、IFN-γ和IL-17A結果顯示:DSS組、CCl4組、CCl4+DSS組小鼠肝臟組織其表達水平，較對照組顯著增加，尤以CCl4+DSS組變化顯著(P＜0.05）;⑦免疫組織化學染色、We

15、sternblot和real-timeQ-PCR檢測肝臟中CollagentypeⅠ、CollagentypeⅢ結果顯示:DSS組較正常對照組變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;CCl4組、CCl4+DSS組較對照組顯著增加，尤以CCl4+DSS組變化顯著(P＜0.05）;⑧免疫組織化學染色、Westernblot和real-timeQ-PCR檢測肝臟組織中α-SMA、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2結果顯示:DSS組較

16、正常對照組變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);CCl4組、CCl4+DSS組較對照組顯著增加，尤以CCl4+DSS組變化顯著（P＜0.05）;⑨與對照組相比，DSS組、CCl4組、CCl4+DSS組小鼠血清中LPS水平顯著增加（P＜0.05）;而CCl4+DSS組與CCl4組比較，其LPS含量顯著升高（P＜0.05）;正常對照組腸系膜淋巴結勻漿液中細菌移位率為0％;DSS組小鼠細菌移位率為80％;橄欖油組勻漿液細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)個別

17、有大腸桿菌生長，其細菌移位率為10％;CCl4組小鼠細菌移位率為60％;CCl4+DSS組細菌移位率為90％;免疫組織化學染色、Westernblot和real-timeQ-PCR檢測結果顯示緊密連接蛋白occludin和claudin-1表達,與對照組相比，DSS組、CCl4+DSS組結腸黏膜蛋白陽性面積顯著減少（P＜0.05），而這兩組之間沒有明顯差異（P＞0.05）;⑩免疫組織化學染色、Westernblot和real-timeQ