DSS所致的慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化及其機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)是肝臟對病毒、酒精、代謝毒物等各種致病因子所致的組織修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化是可逆的，而肝硬化卻難以逆轉(zhuǎn)。因此研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制并盡早干預(yù)對阻止疾病進(jìn)展甚或逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥可加重高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎，因此腸黏膜屏障受損可能在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。
　　在炎癥性腸病(inflammotoryboweldisease，IBD)的研究中

2、發(fā)現(xiàn)，肝膽系統(tǒng)病變是其最常見的腸外表現(xiàn)之一。IBD發(fā)病時(shí)，腸黏膜屏障功能受損，引起腸道菌群失調(diào)，繼發(fā)細(xì)菌移位，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而引起肝損傷。Marshall于1998年正式提出了“腸-肝軸”的概念，指出腸道和肝臟在對機(jī)體免疫防御功能上是相互影響，相互調(diào)節(jié)，密不可分的。腸黏膜屏障功能受損，腸道菌群，內(nèi)毒素進(jìn)入門脈系統(tǒng)進(jìn)而誘發(fā)肝臟疾病。此外，肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎等肝臟疾病常伴有腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinalendotoxe

3、mia，IETM)，這可能與肝病時(shí)腸道內(nèi)毒素吸收增多有關(guān)。
　　肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSCs)的活化增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)?；罨腍SCs分泌大量趨化因子，引起肝巨噬細(xì)胞(Kupffercell，KCs)聚集到損傷部位產(chǎn)生大量TGF-β。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活星狀細(xì)胞表面的Toll樣受體4(Tolllikereceptor4，TLR4)通過MyD-88-N

4、F-κB途徑下調(diào)TGF-β誘導(dǎo)受體，增強(qiáng)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)纖維化的發(fā)生。
　　LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的重要成分，細(xì)菌裂解或黏附在其他細(xì)胞上時(shí)得以釋放。TLR是識別病原微生物的主要受體，其中，TLR4在人體免疫中發(fā)揮重要作用。TLR4是LPS信號導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的表面受體，當(dāng)與LPS結(jié)合后，TLR4通過其胞漿域募集銜接蛋白MyD-88(Myeloiddifferentiationprotein88)，進(jìn)一步作用于其下游分子T

5、NF-α受體活化的因子6(tumornecrosisreceptor-associatedfactor,TRAF6)，隨后引起NF-κB的活化，導(dǎo)致大量促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而介導(dǎo)肝臟病變。GabeleE等的研究，表明非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)伴有腸道炎癥，會明顯促進(jìn)肝臟病變，證實(shí)結(jié)腸炎癥可能通過“腸-肝軸”介導(dǎo)肝臟病變。為此，我們聯(lián)合腹腔注射CCl4與飲用DSS誘導(dǎo)建立了小鼠

6、肝纖維化伴腸道損傷模型，來研究結(jié)腸炎癥對肝臟炎癥和纖維化病變的影響;同時(shí)觀察慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)的肝臟病變情況，并探討內(nèi)毒素及腸肝軸在其中的作用，從而為延緩肝纖維化的進(jìn)展以及IBD的綜合治療提供理論依據(jù)。
　　目的:研究DSS所致的慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的機(jī)制。
　　方法:將50只雄性C57BL/6小鼠按完全隨機(jī)法分為conrtol組（正常飲食），DSS組(間斷飲用2％DSS)，Oliveoil組（腹腔注

7、射橄欖油10μL/g，每周2次），CCl4組（腹腔注射5％CCl4橄欖油10μL/g，每周2次）和CCl4+DSS組(間斷飲用2％DSS聯(lián)合腹腔注射5％CCl4橄欖油10μL/g)，每組10只。結(jié)腸黏膜炎癥程度的評估包括疾病活動指數(shù)(Diseaseactivityindex，DAI)、結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化和組織病理學(xué)評分，檢測結(jié)腸組織中MPO的含量;測定血清LPS水平及細(xì)菌移位率;分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Westernblot技術(shù)和real

8、-timePCR技術(shù)檢測結(jié)腸組織中TNF-α，IFN-γ，IL-17A，緊密連接蛋白o(hù)ccludin，claudin-1的表達(dá)水平;應(yīng)用Haematoxylin&eosinstaining(H&E染色)、Masson'strichromestaining(MT染色)、Siriusredstaining（天狼猩紅染色）等方法觀察肝臟病理學(xué)改變;分別采用免疫組織化學(xué)染色、westernblot和real-timeQ-PCR方法檢測各組小鼠肝

9、臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型膠原、MMP-2、TIMP-2、TLR4、TRAF6和NF-κB的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:①與對照組相比，DSS組和CCl4+DSS組小鼠體重顯著減輕，DAI顯著升高，結(jié)腸壁充血、水腫、長度顯著縮短，結(jié)腸組織病理切片示大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜上皮破壞形成淺潰瘍，病理評分顯著增加;MPO活性顯著升高;免疫組織化學(xué)檢測、Westernblot和real-tim

10、eQ-PCR檢測結(jié)果顯示TNF-α、IFN-γ和IL-17A表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）;而這兩組之間沒有明顯差異(P＞0.05);②肝臟組織H&E顯示:DSS組可見肝內(nèi)匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤增加，肝細(xì)胞排列散亂，肝細(xì)胞水腫、胞漿疏松化;CCl4組及CCl4+DSS組均可見到肝臟組織肝板排列紊亂，肝細(xì)胞水腫、胞漿疏松化，可見肝細(xì)胞空泡樣變性，大量肝細(xì)胞變性壞死，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤，尤以CCl4+DSS組顯著;炎癥評分結(jié)果顯示:DSS

11、組、CCl4組、CCl4+DSS組均顯著高于對照組，尤以重疊組升高明顯;差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;③肝臟組織MT染色、天狼猩紅染色顯示，DSS組可見肝小葉中央靜脈壁纖維染色，匯管區(qū)及小葉間隔內(nèi)少許纖維組織沉積，較對照組無明顯變化;CCl4組及CCl4+DSS組均可見到肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，增生小膽管周圍纖維組織生成，中央靜脈周圍及匯管區(qū)可見纖維組織沉積增多，肝纖維化形成但是此種病變尤以CCl4+DSS組病變嚴(yán)重;纖維化程度分級顯示:

12、DSS組較正常對照組小鼠相差不大（P＞0.05），CCl4組、CCl4+DSS組肝臟纖維化程度分級顯著高，尤以重疊組升高顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;④羥脯氨酸測試盒檢測結(jié)果顯示，同正常對照組相比，DSS組小鼠羥脯氨酸含量略升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);CCl4組小鼠和CCl4+DSS組小鼠羥脯氨酸含量明顯升高，CCl4+DSS組含量顯著高于單純CCl4組小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;⑤血清肝功能檢測顯

13、示，同正常對照組相比，DSS組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)水平明顯升高，白蛋白(albumin，ALB)水平明顯減少（P＜0.05），血清總膽紅素(totalbilirubin，TBIL)、直接膽紅素(directbilirubin，DBIL)水平相差不大(P＞0.05);CCl4組和CCl4+DSS

14、組小鼠ALT、AST、TBIL及DBIL水平明顯增高，ALB水平明顯下降，CCl4+DSS組變化較單純CCl4組小鼠顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;⑥免疫組織化學(xué)染色、Westernblot和real-timeQ-PCR檢測肝臟中TNF-α、IFN-γ和IL-17A結(jié)果顯示:DSS組、CCl4組、CCl4+DSS組小鼠肝臟組織其表達(dá)水平，較對照組顯著增加，尤以CCl4+DSS組變化顯著(P＜0.05）;⑦免疫組織化學(xué)染色、We

15、sternblot和real-timeQ-PCR檢測肝臟中CollagentypeⅠ、CollagentypeⅢ結(jié)果顯示:DSS組較正常對照組變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;CCl4組、CCl4+DSS組較對照組顯著增加，尤以CCl4+DSS組變化顯著(P＜0.05）;⑧免疫組織化學(xué)染色、Westernblot和real-timeQ-PCR檢測肝臟組織中α-SMA、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2結(jié)果顯示:DSS組較

16、正常對照組變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);CCl4組、CCl4+DSS組較對照組顯著增加，尤以CCl4+DSS組變化顯著（P＜0.05）;⑨與對照組相比，DSS組、CCl4組、CCl4+DSS組小鼠血清中LPS水平顯著增加（P＜0.05）;而CCl4+DSS組與CCl4組比較，其LPS含量顯著升高（P＜0.05）;正常對照組腸系膜淋巴結(jié)勻漿液中細(xì)菌移位率為0％;DSS組小鼠細(xì)菌移位率為80％;橄欖油組勻漿液細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)個(gè)別

17、有大腸桿菌生長，其細(xì)菌移位率為10％;CCl4組小鼠細(xì)菌移位率為60％;CCl4+DSS組細(xì)菌移位率為90％;免疫組織化學(xué)染色、Westernblot和real-timeQ-PCR檢測結(jié)果顯示緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1表達(dá),與對照組相比，DSS組、CCl4+DSS組結(jié)腸黏膜蛋白陽性面積顯著減少（P＜0.05），而這兩組之間沒有明顯差異（P＞0.05）;⑩免疫組織化學(xué)染色、Westernblot和real-timeQ