TL1A在實驗性結腸炎相關腸纖維化發(fā)生中的作用.pdf

1、腸纖維化是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)發(fā)病過程中一種常見的嚴重并發(fā)癥，最終可導致腸腔狹窄甚至腸梗阻發(fā)生。由于其發(fā)病機制尚未明確，迄今尚無理想治療方案。因此，深入研究IBD相關腸纖維化的發(fā)病機制可能為臨床治療腸纖維化提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　腸纖維化的發(fā)生是一個復雜動態(tài)的過程，主要由于免疫反應失衡，腸道細胞因子如：轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β

2、，TGF-β)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等表達發(fā)生改變，進而促進以膠原為主的細胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積所致。腸成纖維細胞被認為是腸纖維化發(fā)生的關鍵效應細胞。已有研究證實，腸成纖維細胞(intestinal fibroblasts，IFBs)、

3、效應細胞在上述細胞因子作用下活化，自身發(fā)生向腸肌成纖維細胞(intestinal myofibroblasts，IMFs)轉(zhuǎn)化，其增殖、遷移以及合成與分泌ECM的功能增強，ECM在腸壁大量沉積，最終導致腸纖維化和狹窄形成。
　　由于慢性炎癥的持續(xù)存在，腸道間質(zhì)細胞分泌的膠原代謝酶調(diào)節(jié)平衡發(fā)生紊亂，主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibi

4、tor of metalloproteinases，TIMPs)，這些酶作用失衡導致ECM合成明顯多于降解，最終導致腸纖維化形成。有研究表明，在IBD發(fā)病過程中，MMPs和TIMPs調(diào)節(jié)膠原代謝的功能失衡。同時，各種細胞因子改變間質(zhì)細胞生物學行為離不開細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)。TGF-β1/Smad3信號通路在纖維化過程中是一條最主要的信號傳導通路。有研究證實，腸纖維化發(fā)生過程中TGF-β1/Smad3表達與功能明顯上調(diào)，由其調(diào)節(jié)的間質(zhì)

5、細胞活化亦增強。因此，探討促纖維化因子及其信號通路在腸纖維化中的作用對研究其發(fā)病機制具有重要意義。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor-like ligand1 aberrance，TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(TNF superfamily member15，TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物，可通過與其受體-死亡受體3(death receptor3，DR3)結合，為T淋巴細胞的分化提

6、供協(xié)同刺激信號，影響機體免疫調(diào)節(jié)。近來對TL1A的研究表明，TL1A與IBD密切相關，TNFSF15基因誘導TL1A的表達促進了IBD的發(fā)生與進展，TNFSF15基因作為IBD的易感基因已得到證實。
　　Dr.Targan及其課題組成員研究證實，TL1A及其受體可通過影響腸黏膜T細胞的活化、增殖，誘導Th細胞極化，從而導致腸黏膜免疫系統(tǒng)耐受調(diào)節(jié)紊亂，由此引發(fā)腸道炎癥反應，從而參與IBD的發(fā)生。新近的研究進一步發(fā)現(xiàn)TL1A過表達轉(zhuǎn)基

7、因小鼠結腸炎模型出現(xiàn)腸炎并發(fā)腸纖維化改變。這些都證實了TL1A在IBD腸黏膜T細胞介導的免疫反應中發(fā)揮重要作用，其表達促進了腸黏膜的炎癥和纖維化發(fā)生。盡管TL1A在腸道炎癥中的研究已取得進展，但其在腸道纖維化發(fā)生中的作用機制仍不明確，且干預TL1A能否成為逆轉(zhuǎn)腸纖維化的新靶點尚需進一步探究。為此，本實驗利用野生型(wild type，WT)C57BL/6小鼠及轉(zhuǎn)基因(LCK-CD2-TL1A-GFP-transgenic，L-Tg)兩種

8、遺傳背景的小鼠建立實驗性結腸炎并發(fā)腸纖維化模型，研究TL1A在誘導小鼠腸纖維化中的作用，并探討腸纖維化過程中腸成纖維細胞以及膠原代謝的改變，旨在揭示TL1A在實驗性結腸炎相關腸纖維化發(fā)生中的機制，為探索防治腸纖維化的新靶點提供實驗依據(jù)。實驗內(nèi)容主要包括以下三部分：
　　第一部分 TL1A在TNBS誘導的小鼠實驗性結腸炎炎癥中的作用
　　目的：建立TNBS誘導的實驗性結腸炎小鼠模型，探討TL1A在TNBS誘導的小鼠實驗性結腸炎

9、腸黏膜炎癥中的作用。
　　方法：①采用real-time Q-PCR方法進行LCK-CD2-TL1A-GFP基因型小鼠的鑒定與篩選；②通過三硝基苯磺酸(Trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)乙醇溶液灌腸建立實驗性結腸炎模型，L-Tg小鼠與C57BL/6 WT小鼠(6-8周)隨機分為Control/WT組、EtOH/WT組、TNBS+EtOH/WT組、Control/Tg組、EtOH/Tg組、TNB

10、S+EtOH/Tg組，每組6只；TNBS+EtOH組小鼠禁食24 h，乙醚麻醉后將聚乙烯導管插入肛門約1 cm注入50μLTNBS乙醇溶液，繼續(xù)深入至脾區(qū)(約3 cm～4 cm)再注入100μL灌腸液，每周重復灌腸1次，于第1～2周給予2.0 mg TNBS，第3～4周給予3.0 mgTNBS，最后一次灌腸后第三天處死，EtOH組和Control組分別使用等體積的50%乙醇和蒸餾水溶液灌腸作為對照；③小鼠結腸炎及腸黏膜炎癥評估包括每天體

11、重(Body weight，BW)改變、疾病活動指數(shù)(Disease activityindex，DAI)、結腸形態(tài)學改變和病理評分以及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測；④ELISA法測定血清TNF-α、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)和白細胞介素17A(Interleukin，IL-17A)的水平；⑤Western blot和real-time Q-PCR技術測定腸道組織中TNF-α、IFN

12、-γ、IL-17A的蛋白和mRNA水平。
　　結果：①根據(jù)基因LCK-CD2-TL1A-GFP序列測定小鼠DNA，目的基因在Tg小鼠成像在192 bp位置，而WT小鼠基因測定成像，在192 bp位置未檢測到目的基因，據(jù)此可以篩選鑒定Tg小鼠；②在兩種小鼠中，與Control組和EtOH組相比，TNBS+EtOH組小鼠經(jīng)TNBS乙醇溶液灌腸后，出現(xiàn)厭食、精神狀態(tài)萎靡、體重下降、DAI評分與病理評分增加，結腸質(zhì)地變硬，長度縮短，腸壁出

13、現(xiàn)水腫、充血，結腸組織病理切片顯示腸道結構破壞，黏膜及黏膜下層出現(xiàn)中性粒細胞浸潤；兩種小鼠的Control組和EtOH組腸道改變均無明昱差異，TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組腸道炎癥反應增強；③MPO結果顯示：在WT和Tg小鼠組，與Control組和EtOH組相比，TNBS+EtOH組小鼠結腸MPO活性明顯升高，而兩種小鼠的Control組和EtOH組間MPO均無明顯差異，TNBS+EtOH/Tg組結腸MPO活性較

14、TNBS+EtOH/WT組顯著升高；④ELISA結果顯示：在WT和Tg小鼠組，TNBS+EtOH組小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平較Control組和EtOH組明顯升高，兩種小鼠的Control組和EtOH組血清細胞因子無明顯差異，同時TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組升高更為明顯；⑤應用Western blot和real-time Q-PCR技術檢測小鼠腸組織中TNF-α、IFN-γ和IL-17A的

15、表達，結果顯示，TNBS+EtOH/WT組較Control/WT組小鼠腸組織炎癥因子表達升高，TNBS+EtOH/Tg組較Control/Tg組小鼠腸組織炎癥因子表達升高，同時TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組升高更明顯，在兩種小鼠的Control組和EtOH組腸道中表達無明顯差異。
　　結論：通過TNBS灌腸方法成功建立了實驗性結腸炎模型，TL1A能促進TNF-α、IFN-γ和IL-17A產(chǎn)生，上調(diào)Th1和T

16、h17介導的免疫反應，從而增強實驗性結腸炎小鼠腸道黏膜炎癥的發(fā)生。
　　第二部分 TL1A在TNBS誘導的小鼠實驗性結腸炎相關腸纖維化發(fā)生中的作用與機制研究
　　目的：深入探討TL1A在TNBS誘導實驗性結腸炎相關腸纖維化發(fā)生中的作用及機制。
　　方法：①造模方法與實驗分組同第一部分：②Masson's trichromestaining(MT染色)、天狼猩紅染色檢測膠原沉積評估腸纖維化程度改變；③采用免疫組織化學法檢

17、測Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原、TIMP-1、波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)以及TGF-β1/Smad3在小鼠結腸組織中的的表達；④Western blot和real-timeQ-PCR技術測定腸組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、Vimentin、α-SMA、TGF-β1/Smad3蛋白和mRNA水平。
　　結果：①MT染色和天狼猩紅染色顯示，在TNBS誘導的WT和T

18、g小鼠實驗性結腸炎模型中，與Control組小鼠相比，TNBS+EtOH組小鼠結腸黏膜下層和漿膜層出現(xiàn)大量膠原沉積，而兩類小鼠的Control組和EtOH組均無明顯差異，TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組改變更為明顯；②采用免疫組織化學染色顯示，在WT和Tg小鼠組，TNBS+EtOH組成纖維細胞的增殖與活化較Control組和EtOH組增強，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Vimentin及α-SMA合成與分泌增加；TGF-β1

19、/Smad3在Control組僅少量表達，TIMP-1表達甚微或無表達，EtOH組與Control組比較，上述指標表達量有所增加，但無統(tǒng)計差異，這可能與乙醇溶劑輕微損傷腸道黏膜導致的組織修復有關，且Tg與WT小鼠之間也無明顯差別，而在TNBS+EtOH組纖維化發(fā)生過程中TGF-β1、Smad3、TIMP-1陽性表達增加，陽性表達部位可在腸道組織各層且細胞胞漿與細胞胞膜均有表達，TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組更為明

20、顯；③Western blot和real-time Q-PCR測定腸道組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、Vimentin、α-SMA、TGF-β1、Smad3、表達，結果顯示：在WT和Tg小鼠組，TNBS+EtOH組較Control組腸組織中表達明顯升高，Control組與EtOH組相比蛋白和mRNA表達無差異；TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組表達更為明顯。
　　結論：TL1A過表達可促進TNBS誘導的

21、實驗性結腸炎小鼠腸成纖維細胞活化、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原合成增強以及TIMP-1表達上調(diào)；TGF-β1/Smad3信號通路介導的腸成纖維細胞活化，可能是腸道炎癥并發(fā)腸纖維化的機制之一。
　　第三部分抗TL1A抗體對小鼠T細胞轉(zhuǎn)移實驗性結腸炎相關腸纖維化的影響
　　目的：探討抗TL1A抗體對T細胞移植結腸炎小鼠腸道炎癥及纖維化改變的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：①運用T細胞分選技術分別提取來自建立野生型(wild type，WT)C

22、57BL/6小鼠和LCK-CD2-TL1A-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+CD45RBhigh原始T細胞，向Rag-/-小鼠腹腔內(nèi)注入，建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，預防性干預是在注射CD4+CD45RBhighT細胞后第一天開始給予抗TL1A抗體，每周兩次，持續(xù)6周，抗體劑量為500μg；治療性干預則是在注射CD4+CD45RBhigh細胞四周后即第29天或體重下降超過10%時給予抗TL1A抗體干預，每周兩次，持續(xù)4周，抗體劑量為500μg；

23、預防性干預與治療性干預同期給予同種型免疫球蛋白G(Isotype)作為對照組。實驗分組如下：(1)WT-Prevention Isotype組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，預防性給予同種型免疫球蛋白G作為對照(Isotype)；(2)WT-Prevention Ab組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，預

24、防性給予抗TL1A抗體干預(Ab)；(3)Tg-Prevention Isotype組：使用來自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，預防性給予同種型免疫球蛋白G作為對照(Isotype)；(4)Tg-Prevention Ab組：使用來自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，預防性給予抗TL1A抗體干預(Ab)；(5)WT-Trea

25、tment Isotype組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45 RBhighT細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，治療性給予同種型免疫球蛋白G作為對照(Isotype)；(6)WT-Treatment Ab組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，治療性給予抗TL1A抗體干預(Ab)；(7)Tg-Treatment Isotype組：使用來自Tg小鼠的CD4+C

26、D45RBhigh T細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，治療性給予同種型免疫球蛋白G作為對照抗體(Isotype)；(8)Tg-Treatment Ab組：使用來自Tg小鼠的CD4+CD45RBhigh T細胞注射Rag-/-小鼠建立T細胞轉(zhuǎn)移結腸炎模型，治療性給予抗TL1A抗體干預(Ab)；②結腸組織切片經(jīng)Haematoxylin& eosin staining(H&E染色)觀察腸黏膜炎癥，Masson's trich

27、rome staining(MT染色)及天狼猩紅染色觀察腸纖維化程度并行病理評分；③免疫組織化學方法檢測結腸組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、Vimentin、α-SMA和TGF-β1/Smad3蛋白表達。
　　結果：①采用H&E染色、MT染色及天狼猩紅染色結果證明T細胞移植方法建立了實驗性小鼠結腸炎相關腸道纖維化模型。Tg-PreventionIsotype組與WT-Prevention Isotype相比較，Tg-Trea

28、tment Isotype組與WT-Treatment Iostype組相比較，Tg小鼠腸道腺體結構破壞明顯，黏膜下層出現(xiàn)明顯炎癥細胞侵潤，膠原沉積明顯增加，炎癥及纖維化病理評分升高；使用抗TL1A抗體進行預防性和治療性干預發(fā)現(xiàn)，WT-Prevention Ab組與WT-Prevention IsotyFe組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-PreventionIsotype組比較、WT-Treatment Ab組與WT-

29、Treatment Isotype組比較，Tg-Treatment Ab組與Tg-Treatment Isotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較，抗TL1A抗體干預后腸黏膜損傷與膠原沉積減輕，病理評分降低，預防性干預較治療性干預降低病理評分效果更明顯；WT-Prevention Isotype組與WT-Treat

30、ment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-TreatmentIsotype組比較，腸道炎癥與纖維化改變無差異。②免疫組織化學檢測腸組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原和TIMP-1結果顯示：Tg-Prevention Isotype組與WT-Prevention Isotype組相比較，Tg-Treatment Isotype組與WT-TreatmentIostype組相比較，Tg小鼠結腸組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ膠

31、原和TIMP-1陽性面積比值升高；WT-Prevention Ab組與WT-Prevention Isotype組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Prevention Isotype組比較、WT-Treatment Ab組與WT-Treatment Isotype組比較，Tg-Treatment Ab組與Tg-TreatmentIsotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較

32、、Tg-Prevention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較，抗TL1A抗體干預之后Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原、TIMP-1陽性面積比值降低；WT-Prevention Isotype組與WT-Treatment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-TreatmentIsotype組比較，陽性面積比值無明顯差異。③免疫組織化學檢測腸組織中Vimentin和α-SMA表達，結果顯示：Tg-Prev

33、ention Isotype組與WT-Prevention Isotype組相比較，Tg-Treatment Isotype組與WT-TreatmentIostype組相比較，Tg小鼠結腸組織中Vimentin及α-SMA陽性面積比值升高；WT-Prevention Ab組與WT-Prevention Isotype組比較、Tg-PreventionAb組與Tg-Prevention Isotype組比較、WT-Treatment Ab

34、組與WT-TreatmentIsotype組比較，Tg-Treatment Ab組與Tg-Treatment Isotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較，抗TL1A抗體干預之后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Vimentin及α-SMA陽性面積比值降低，預防效果更明顯；WT-PreventionIsotype組與WT-Tre

35、atment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-Treatment Isotype組比較，陽性面積比值無明顯差異；④免疫組織化學檢測腸組織中TGF-β1\Smad3結果顯示：Tg-Prevention Isotype組與WT-Prevention Isotype組相比較，Tg-Treatment Isotype組與WT-TreatmentIostype組相比較，Tg小鼠結腸組織中TGF-β1\Sm

36、ad3陽性面積比值升高；WT-Prevention Ab組與WT-Prevention Isotype組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Prevention Isotype組比較、WT-Treatment Ab組與WT-TreatmentIsotype組比較，Tg-Treatment Ab組與Tg-Treatment Isotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較、Tg-P

37、revention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較，抗TL1A抗體干預之后TGF-β1\Smad3陽性面積比值降低；WT-Prevention Isotype組與WT-Treatment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-Treatment Isotype組比較，陽性面積比值無明顯差異。
　　結論：抗TL1A抗體可減輕TL1A介導的結腸炎相關腸纖維化，預防性干預效果優(yōu)于治療性干