凝膠上StainS-All磷酸化蛋白質(zhì)檢測技術(shù)的研究.pdf

1、目的:
　　 1.研究開發(fā)快速、靈敏、選擇性強(qiáng)的磷酸化蛋白質(zhì)檢測方法;
　　 2.為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究人員提供合適的染色方法。
　　 方法:
　　 1.利用Stains-All染料，對應(yīng)用該染料的原始磷酸化蛋白質(zhì)檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，考察影響染色效果的各個因素，包括染料濃度，染色液溶劑組成、染色時間等;增加顯色步驟，提高染色靈敏度，建立簡便、快速、靈敏、選擇性強(qiáng)的檢測方法。
　　 2.采用聚丙烯酰胺

2、凝膠電泳(SDS-PAGE)分別分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白、動物組織樣品和磷酸酶處理前后的酪蛋白，將所得凝膠用3種磷酸化蛋白質(zhì)檢測方法分別進(jìn)行染色，比較這些方法的選擇性、靈敏度、線性范圍等信息。
　　 3.利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證改進(jìn)的Stains-All磷酸化蛋白質(zhì)檢測的專屬性。
　　 結(jié)果:
　　 1.對原始的Stains-All磷酸化蛋白質(zhì)檢測方法即SA(Stains-All)法進(jìn)行了改進(jìn)，成功建立新型的磷酸化蛋白質(zhì)檢測方

3、法即ISA(improved Stains-All)法，操作步驟如下:
　　 (1)水洗:將電泳后的聚丙烯酰胺凝膠置于30％甲酰胺中水洗2次，每次20min，溫和振搖;
　　 (2)染色:將凝膠置于染色液(0.01％ Stains-All，30％甲酰胺，45 mM Tris-HCl，pH9.2)中染色20 min，溫和振搖;
　　 (3)顯色:將凝膠置于顯色液（1％ EDTA-2Na，30％乙醇）中顯色l min

4、。
　　 2.通過3種方法（ISA法、SA法、Pro-Q Diamond法）的比較，顯示ISA法的靈敏度達(dá)到0.5-1.0 ng，優(yōu)于SA法，與Pro-Q Diamond法相當(dāng);選擇性方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ISA法對磷酸化蛋白質(zhì)有良好的選擇性;
　　 3.通過質(zhì)譜技術(shù)在小鼠心肌等動物組織的凝膠上檢測到了25個磷酸化蛋白質(zhì)、27個磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步證明了ISA法對磷酸化蛋白質(zhì)檢測的專屬性。
　　 結(jié)論: