蜜蜂工蜂和雄蜂胚胎期發(fā)育蛋白質組及磷酸化蛋白質組研究.pdf

1、在蜜蜂社會里，工蜂和雄蜂是對蜂群社會組織和種群繁衍具有重要貢獻的兩個綴型。工蜂和雄蜂分別是二倍體和單倍體，二者在遺傳上的差異決定了其生理發(fā)育和社會行為存在諸多生物學不同。胚胎發(fā)育期是蜜蜂生命周期中的關鍵時期，成年蜂的各種器官雛形都在胚胎期形成。雖然利用基于雙向電泳（2-DE）的蛋白質組學技術對工蜂和雄蜂胚胎期發(fā)育的分子基礎進行初步探索，但只鑒定到105個蛋白質，僅覆蓋了7％的蜜蜂蛋白質組（15323個蛋白質），這在一定程度上限制了對胚胎

2、發(fā)育分子基礎的客觀認識。隨著質譜分辨率、靈敏度和精確度技術的快速發(fā)展，其蛋白質鑒定能力至少是2-DE蛋白質組的20倍以上。蛋白質組覆蓋深度對全面深入解析蜜蜂胚胎發(fā)育分子基礎至關重要。磷酸化是最為重要的蛋白質翻譯后修飾之一，對蛋白質功能具有重要調節(jié)作用，已被廣泛應用到生命科學研究的各個領域。但利用基于高分辨質譜的蛋白質組和磷酸化蛋白質組技術對工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育分子基礎的研究還尚未進行。本研究利用基于高分辨質譜為主的shotgun蛋白質組學

3、研究方法、非標定量技術、IMAC（固相金屬離子親和色譜）和TiO2磷酸化蛋白富集等技術以及蛋白質相互作用、激酶預測等生物信息學分析手段，對意大利蜜蜂（意蜂）工蜂和雄蜂的胚胎期蛋白質組和磷酸化蛋白質組進行系統(tǒng)分析，以期探明調控蜜蜂胚胎發(fā)育的關鍵代謝通路、蛋白質和激酶，為蜜蜂胚胎發(fā)育生物學和對胚胎發(fā)育機理的進一步研究提供了理論和實踐依據(jù)。
　　在意蜂工蜂和雄蜂胚胎期，共鑒定3443個蛋白質，與2-DE的胚胎蛋白質相比，鑒定蛋白質的覆蓋

4、率提高了30倍以上。盡管蜜蜂胚胎在3個發(fā)育階段的蛋白質表達特點差異很大，但是一個核心蛋白質組主要參與蛋白質合成、能量代謝、發(fā)育和轉運相關的代謝通路對胚胎發(fā)育發(fā)揮基本的保障功能。1日齡是胚胎發(fā)育的準備階段，主要功能是提供營養(yǎng)和子核分裂，因此胚胎表達和上調表達的蛋白質主要與營養(yǎng)儲存和核酸代謝相關，從而保證胚胎細胞對營養(yǎng)的需求和細胞增殖對核酸的需求;2-3日齡是器官形成的關鍵時期，器官系統(tǒng)在46hr以后逐步形成的，此時高表達及上調表達的蛋白主

5、要參與細胞周期、抗氧化、細胞骨架以及組織形態(tài)發(fā)生等活動，為胚胎組織和器官雛形構建提供的細胞代謝保障和分子材料。工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育基本都在3天完成，但雄蜂為了應對自身體型大的發(fā)育需求，形成了不同于工蜂胚胎發(fā)育的策略。雄蜂的胚胎器官形成相關的代謝通路較工蜂啟動早且持續(xù)時間長，以積累足夠的構建器官雛形的分子材料。另外，雄蜂的細胞骨架系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)功能的加強以滿足胚胎發(fā)育的生理需求。為了探索對胚胎的基因改造，RNAi的初步結果表明在胚胎發(fā)育的

6、前48小時對基因進行沉默的效果較好。
　　應用IMAC和TiO2兩種技術優(yōu)點互補的磷酸化肽段的富集方法，對工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育進行的磷酸化蛋白質組分析和激酶預測，鑒定到的2438個胚胎蛋白質的6342個肽段上的6577個位點發(fā)生了磷酸化修飾，預測了91個激酶，這是迄今覆蓋度最深的蜜蜂胚胎磷酸化蛋白質組研究。在蜜蜂胚胎發(fā)育過程中，磷酸化對轉錄、組織形態(tài)發(fā)生、細胞周期調控/凋亡、細胞骨架和信號轉導相關通路具有重要調控作用，相應CDK、M

7、APK、RSK激酶的持續(xù)表達促進了細胞分裂、蛋白質合成、組織分化等生命活動的進行。工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育早期通過一系列PKA激酶調控能量代謝、信號傳導和組織分化，為細胞增殖和胚盤形成提供物質和能量。胚胎發(fā)育中后期DYRK和CDK亞家族的激酶調控基因轉錄、蛋白質合成和胚層分化等代謝活動，foxO和wnt等通路的激活對細胞抗氧化應激、胚層分化、器官形成和背索閉合等過程的完成起決定性作用。磷酸化修飾對工蜂和雄蜂胚胎發(fā)育調控也存在顯著差異。胚胎發(fā)育

8、早期，工蜂mnb激酶對細胞增殖的負調控以及MAPK3激酶磷酸化的T564位點對基因轉錄和細胞骨架進程的抑制作用，使工蜂胚胎發(fā)育未被激活，處于初級發(fā)育階段。而此時雄蜂胚胎CDK12激酶的充分激活促進了轉錄進程，進而被激活的RNA轉運通路送至核糖體進行翻譯，雄蜂已開始大量合成蛋白質。胚胎發(fā)育中期，工蜂胚胎CDK1激酶在Y15位點上的磷酸化造成激酶失活，制約了有絲分裂等細胞周期的進行，raf激酶的高度磷酸化限制了與胚胎體軸形成、原腸胚及成蟲盤

9、相關信號通路的激活，而雄蜂DCAMKL激酶的高活性和wnt信號通路的激活全面推進了大腦等組織器官的形成。胚胎發(fā)育后期，工蜂胚胎激活的foxO通路為胚胎提供能量和抗氧化保護，notch、hippo、wnt和hedgehog通路的激活以及CDK9、CDK12和mnb的活性增加和SLK的高磷酸化，推動了細胞生長、轉錄、翻譯和各種器官構建等生命活動的進行。而雄蜂Abl上S637的磷酸化對細胞骨架組織、表皮神經(jīng)分化、細胞遷移和細胞周期的負調控作用