甘草與反藥配伍對P-糖蛋白影響的相關(guān)研究及配伍禁忌對口服藥物腸道吸收機制的探討.pdf

1、背景和目的:
　　 P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是屬于ABC(ATP—bindingcassette)轉(zhuǎn)運體超家族的能量依賴性膜蛋白，分子量為170kDa，可發(fā)揮外排泵作用，將細胞內(nèi)的化合物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運至胞外，從而降低細胞內(nèi)的藥物濃度。P-gp除在腫瘤細胞中高度表達外，在正常機體組織和器官如肝臟、腎臟、胎盤、大腦、睪丸及腸刷狀緣膜等部位均有高水平的表達。存在于腸上皮細胞刷狀緣膜中的P-gp能將藥物從漿膜

2、側(cè)泵回至粘膜側(cè)而進入腸腔排出，導致藥物透膜吸收減少，血藥濃度降低。因此，受腸粘膜P-gp調(diào)控的經(jīng)腸道吸收藥物可以通過抑制腸粘膜P-gp的活性而增加吸收，提高生物利用度。現(xiàn)已證實，許多藥物均為腸粘膜P-gp的抑制劑，例如維拉帕米、環(huán)胞菌素A、奎尼丁、一些表面活性劑等。
　　 中藥十八反是中醫(yī)界沿襲數(shù)千年的用藥禁忌。有研究表明，甘草與反藥合用前后對細胞色素P450具有不同的調(diào)控作用。令人感興趣的是P-gp的底物特異性很大程度上與細胞

3、色素P450同工酶(CYP3A1-3)相似，二者有很多重疊的底物，如利福平、利多卡因、地高辛以及環(huán)孢菌素等。那么，這些反藥對合用前后也有可能對腸粘膜P-gp產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用，這可能是反藥合用引起臨床上產(chǎn)生毒性的原因。文獻檢索表明，目前國內(nèi)外尚未見由探討腸粘膜P-gp的表達同中藥配伍合理性之間的研究報告，因此探討中藥反藥對合用后毒性增加是否同P-gp表達的改變等研究具有較高的學術(shù)價值。
　　 本課題選擇十八反藥對中的甘草，甘遂，

4、海藻，京大戟作為模型藥進行研究。參考2010年版《中國藥典》對所選中藥材進行質(zhì)量控制后，中藥材按傳統(tǒng)方法進行煎煮，制備甘草水提液，反藥水提液及甘草反藥合煎水提液，甘草反藥合并水提液。選擇典型的P-gp抑制劑維拉帕米為陽性對照藥物，以生理鹽水為陰性對照藥物。將中藥水提液，維拉帕米，生理鹽水分別對Wistar大鼠灌胃造模，利用體外擴散池法(Ussingchamber)，Real-timePCR法，在體Insitu實驗法，分析甘草與反藥合用前

5、后對大鼠腸粘膜P-gp表達的影響。實驗中，將P-gp典型底物藥物羅丹明123(R123)和旁細胞途徑藥物熒光素鈉(CF)分別作為轉(zhuǎn)運方式的標志物進行檢測。Ussingchamber體外實驗中，R123和CF都具有可見光范圍的熒光，故應用熒光分光光度計進行檢測，檢測靈敏度高。實驗成功建立了熒光分光光度計對腸粘膜透過液中R123和CF檢測的方法學，選取了灌胃的最佳濃度及能夠反應腸道吸收機制的最佳腸段。Insitu體內(nèi)實驗中，應用LC-MS/

6、MS首次建立了大鼠血漿中檢測R123的方法學，期望通過對R123及CF的檢測能間接地說明甘草反藥合用前后對P-gp調(diào)控的規(guī)律性。基因水平實驗中，選擇mdrla為目的基因，各個組織中表達量相對恒定的β-actin為內(nèi)參基因分析造模大鼠不同區(qū)段腸道的P-gp表達情況，闡明甘草反藥合用引起毒性增加的可能作用機制。
　　 內(nèi)容和結(jié)果:
　　 中藥根據(jù)不同產(chǎn)地、不同炮制方法，質(zhì)量存在很大差別，因此要首先對實驗中所用的甘草，甘遂，海

7、藻，京大戟進行質(zhì)量控制。參考2010年版《中國藥典》含量測定的方法，分別選擇甘草酸銨，甘草苷，丹酚酸B（首次從京大戟中分離得到），大戟二烯醇為對照品。選擇InertsilODS-SPC18柱(4.6×150mm，5μm)為色譜柱;柱溫:40℃;流動相:A為乙腈，B為0.05％磷酸水溶液。其中甘草酸銨，甘草苷用于甘草水提液的含量測定:波長為237nm;采取梯度洗脫。大戟二烯醇用于甘遂的含量測定:流動相:A為乙腈，B為0.05％磷酸水溶液;

8、A∶B=95∶5;波長為237nm，流速:1ml/min。大戟二烯醇，丹酚酸B用于京大戟含量測定:波長為210nm;采用梯度系統(tǒng)。甘草酸銨標準品，甘草苷標準品，丹酚酸B標準品，大戟二烯醇標準品（A用于甘遂水提液檢測，B用于京大戟水提液檢測）在各自的色譜條件下，重現(xiàn)性良好，各自保留時間分別約為:43.09±0.17min,25.02±0.10min,40.09±0.07min,13.46±0.18min(A),74.09±0.14min(

9、B)。含量測定中，甘草水提液中所含甘草苷的量為0.6％，甘草酸的量為2.2％，甘遂水提液中所含大戟二烯醇的量為0.2％，均大于藥典規(guī)定的含量。實驗首次對京大戟進行含量測定，京大戟水提液中含大戟二烯醇的量為0.1％，丹酚酸B的量為2.0％。
　　 應用熒光分光光度計，建立R123及CF檢測方法學。R123的激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為535nm，CF的激發(fā)波長為490nm，發(fā)射波長為520nm。R123在(10～200)μg·

10、l-1，熒光強度對濃度進行回歸，回歸方程為Y=0.2237X+2.5658(r2=0.9993)，回收率和日內(nèi)精密度分別為:99.9％和0.9％。CF在(200～2000)μg·l-1，熒光強度對濃度進行回歸，回歸方程為Y=0.6386X+0.0679（r2=1），回收率和日內(nèi)精密度分別為:99.8％和2.3％。
　　 應用LC-MS/MS，建立大鼠血漿中R123的檢測方法學。0.1ml血漿樣品用乙酸乙酯-二氯甲烷提取。用羅丹明

11、6G作為內(nèi)標。利用C18柱分離R123及R6G。檢測方式為正離子電離，多離子反應監(jiān)測(MRM)，用于定量分析的離子為R123m/z:345-285，R6Gm/z:443-415。樣品運行時間為4min，標準曲線的濃度范圍為:1-200ng/ml，最低檢測限為1ng/ml。低濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度及日間精密度分別為6.96％和9.2％，中間濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度及日間精密度分別為3.33％和3.02％，高濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度及日間

12、精密度分別為1.41％和2.09％，三種濃度的質(zhì)控樣品在日間精密度及日內(nèi)精密度中的誤差均在0.12％-3.24％之間。
　　 使用體外Ussingchamber實驗評價R123、CF經(jīng)不同區(qū)段腸粘膜的經(jīng)時吸收方向和分泌方向的累計透過率和表觀滲透系數(shù)(Papp)及泵出比ER。計量資料統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示。藥物不同濃度不同區(qū)段的Papp比較用析因設(shè)計資料的方差分析，不同組間多重比較采用SNK法檢驗;各組累計透過率的比

13、較用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，不同組間多重比較采用LSD法檢驗;各組間不同方向，不同區(qū)段的Papp及ER的均數(shù)比較用析因設(shè)計資料的方差分析，不同組間多重比較采用SNK法檢驗。顯著性標準為P＜0.05。
　　 生理鹽水組，R123在空腸回腸結(jié)腸中的分泌方向轉(zhuǎn)運大于吸收方向轉(zhuǎn)運，泵出比ER分別為空腸ER=5.69±4.13;回腸ER=3.51±2.20;結(jié)腸ER=2.02±0.84。表明其在小腸中的轉(zhuǎn)運是以分泌為主，說明泵出系統(tǒng)的存在

14、。維拉帕米組，R123在空腸回腸結(jié)腸中的吸收方向轉(zhuǎn)運大于分泌方向，泵出比分別為空腸:ER=0.42±0.33，回腸ER=0.41±0.25，結(jié)腸ER=1.23±1.16。維拉帕米作為P-gp的典型抑制劑，表明其口服后，可顯著抑制P-gp的表達，使R123在小腸中的轉(zhuǎn)運是以吸收為主。
　　 使用體外Ussingchamber實驗考察不同濃度（0.25g/ml，0.5g/ml，1g/ml）中藥水提液灌胃大鼠1周后，R123經(jīng)空腸粘膜

15、M-S方向和S-M方向的影響。計量資料統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示。各組標準曲線濃度與吸光度的效應關(guān)系用線性回歸分析（LinearRegression）。各組中分泌方向累計透過率與吸收方向累計透過率的比較用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析;各組間不同方向，不同區(qū)段的Papp及ER的均數(shù)比較用析因設(shè)計資料的方差分析，不同組間多重比較采用SNK法檢測。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3種濃度的甘草水提液灌胃后，R123在吸

16、收方向與分泌方向中的透過與生理鹽水組（0.28±0.15和1.16±0.46）比較，沒有顯著性差異。3種濃度的甘遂水提液，海藻水提液，京大戟水提液灌胃后，R123經(jīng)空腸粘膜M-S方向的透過按濃度增高而增加。但是1g/ml灌胃時，R123分泌方向的透過均高于0.25g/ml，0.5g/ml的透過。提示濃度過高可能影響了P-gp轉(zhuǎn)運的飽和性。故選擇0.5g/ml作為中藥灌胃濃度。
　　 將大鼠灌胃各種中藥液，1周后用體外Ussing

17、chamber法評價各種藥液對R123經(jīng)各區(qū)段腸粘膜透過性的影響。研究空腸吸收時，實驗發(fā)現(xiàn)甘草液可以降低R123經(jīng)空腸粘膜吸收分泌雙方向的轉(zhuǎn)運，甘遂使R123吸收增加，分泌減小，ER顯著降低，甘遂合煎與合并液吸收分泌之間無統(tǒng)計學差異，均可以使R123分泌顯著降低，吸收顯著增加，ER顯著降低;海藻使分泌吸收雙方向透過增加，但ER有降低趨勢，海藻合煎與合并液吸收分泌之間無統(tǒng)計學差異，均可以使雙方向透過增加，但是ER顯著降低京大戟可以使分泌降

18、低，吸收增加，ER顯著降低，其合煎液與合并液之間無統(tǒng)計學差異，但是與京大戟相比，分泌顯著降低，吸收增加。研究回腸方向時，甘草降低R123吸收分泌雙方向的透過。除海藻外，甘遂與京大戟均時R123吸收方向透過增加，分泌方向減小，ER顯著降低。甘草與甘遂，海藻，京大戟合用時，合煎與合并組之間均無統(tǒng)計學差異。除海藻與甘草合用時使雙方向透過顯著增加，且ER與空白組無顯著性差異外，甘草與甘遂合并及甘草與京大戟合并均可使分泌方向降低，吸收方向R123

19、增加，ER與空白組對比，差異具有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)腸時，藥物合用后各自之間沒有統(tǒng)計學差異。除京大戟可使R123分泌方向轉(zhuǎn)運降低外，其余藥物組的吸收及分泌方向均為升高趨勢。
　　 將大鼠灌胃各種中藥液，1周后用體外Ussingchamber法評價各種藥液對CF經(jīng)各區(qū)段腸粘膜透過性的影響。除了回腸中，京大戟使CF在吸收分泌方向透過均增加外，其余藥物組在空腸及回腸中均使CF的透過顯著降低?？漳c與回腸各組相比趨勢相同，提示藥物對空腸與回

20、腸的影響相似。各自藥物在結(jié)腸實驗時，均使CF的透過顯著降低。
　　 基因水平實驗中，選擇mdrla為目的基因，各個組織中表達量相對恒定的β-actin為內(nèi)參基因分析造模大鼠不同區(qū)段腸道的P-gp表達情況，闡明甘草反藥合用引起毒性增加的可能作用機制。實驗結(jié)果用x±s表示，所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行析因設(shè)計資料的方差分析，不同組間多重比較采用LSD法檢測;以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義?？疾彀l(fā)現(xiàn)，空白組空腸，

21、回腸，結(jié)腸mdrla表達依次升高，而維拉帕米組空腸，回腸，結(jié)腸mdrla表達，依次降低?？漳c，回腸組海藻及其與甘草合并組對mdrla表達與空白組相比沒有統(tǒng)計學差異。甘遂具有降低mdrla表達的趨勢，但是與空白組相比，沒有統(tǒng)計學差異。京大戟可以顯著降低mdrla的表達，與空白組相比，差異具有統(tǒng)計學差異。甘遂與甘草合并，京大戟與甘草合并，均可以降低mdrla的表達。各自藥物對結(jié)腸mdrla的影響均無顯著性差異。
　　 根據(jù)體外結(jié)果，

22、應用小腸作為主要部位，在體Insitu實驗測定大鼠灌胃甘草水提液，京大戟水提液，甘草京大戟合并藥液后，R123和CF在血漿中藥物濃度的變化，計算各種藥動學參數(shù)。實驗資料結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包軟件進行統(tǒng)計分析。CF各組濃度與峰面積的效應關(guān)系用線性回歸分析(LinearRegression)。R123及CF藥物在腸道內(nèi)吸收后Cmax、Tmax、AUC0-240min、F的均數(shù)比較各自均采用單向方差分

23、析（One-WayANOVA），如果有顯著性差異，則組間兩兩比較采用LSD法（方差齊性時）或DunnettT3法（方差不齊時）;LDH及總蛋白含量測定的均數(shù)比較采用采用單向方差分析（One-WayANOVA），如果有顯著性差異，則組間兩兩比較采用LSD法（方差齊性時）或DunnettT3法（方差不齊時）。以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗發(fā)現(xiàn)甘草組R123最高血漿濃度Cmax、曲線下面積AUC0-240mim和生物

24、利用度F與對照組比較無統(tǒng)計學差異，而京大戟、合并組Cmax、AUC0-240min和F均大于對照組(P＜0.01)，并且合合并組AUC0-240和F與京大戟組相比，增加了將近一倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，;大鼠灌胃京大戟后，CF的各藥動學參數(shù)與對照組比較無統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論和討論
　　 結(jié)合體內(nèi)外實驗結(jié)果，可以推斷甘遂和京大戟可以抑制P-gp的表達，且京大戟的抑制作用更加明顯，甘遂與京大戟在與甘草分別合并

25、使用后對P-gp表達的抑制加強，這可能是其產(chǎn)生配伍禁忌的原因之一。海藻和甘草單用及合用對P-gp的表達的影響沒有統(tǒng)計學意義，提示二者配伍禁忌可能不是由P-gp影響造成的。那么在臨床上，甘遂與京大戟有可能配伍一些易產(chǎn)生耐藥性的抗腫瘤藥物，或者制成腫瘤藥物耐藥性逆轉(zhuǎn)劑，以增加抗癌療效;也可以嘗試在藥物的制備中，適當加入甘遂或京大戟，改善一些P-gp底物藥物的吸收。而甘遂對CF的作用可能是甘遂一方面抑制其吸收，另一方面抑制分泌，吸收和分泌量都

26、減少，從而導致其最終生物利用度與對照組無差異，這結(jié)果與甘遂是P-gp的抑制劑并不矛盾，京大戟使CF吸收分泌雙方向均增加，且ER與空白組無統(tǒng)計學差異，提示可能是由于打開了腸黏膜緊密連接的原因。
　　 中醫(yī)素有“十方九草，無草不成方”之說，甘草配伍其他藥物可以起到增強藥物療效的作用。實驗表明甘草對P-gp沒有影響，甘草與反藥合用后可能直接或間接對P-gp產(chǎn)生調(diào)控作用，改變了胃腸粘膜通透性，從而引起不同藥物吸收的增加。這為將來對甘草“

27、調(diào)和諸藥、增強療效”的作用機制研究，提供了一個很好的方向，可以試圖從甘草對腸粘膜中各種轉(zhuǎn)運蛋白的影響方面進行研究，科學地認識甘草對不同轉(zhuǎn)運方式的藥物經(jīng)胃腸道粘膜滲透和吸收影響的可能機制，從而為臨床廣泛應用甘草配伍其他藥物提高療效提供更多的依據(jù)。
　　 甘草反藥合用后與單用反藥相比，對P-gp抑制作用增強，但是合煎與合并兩種炮制方法對P-gp的影響無差異。我們可以推斷甘草與反藥配伍有毒，可能是甘草對反藥有協(xié)同作用，使反藥中某些抑制