天然牛黃與酶促牛黃中膽酸類(lèi)成分的血清藥物化學(xué)研究.pdf

1、第一部分:
　　 膽酸類(lèi)成分血藥濃度測(cè)定方法的建立
　　 目的:
　　 建立大鼠血清中膽酸類(lèi)的HPLC-ELSD分析測(cè)定方法，為兩種牛黃血清藥物化學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)研究提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)色譜柱:AgelaVenusilMPC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，0.2％甲酸水和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0ml·min-1;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD);柱溫87.5

2、℃，氮?dú)饬魉?.0L·min-1，ImpactOFF進(jìn)行檢測(cè)。(2)血清樣品處理的方法:取血清100μl，加入甲醇900μl，渦旋混勻，12000rpm離心5min;取上清液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾;取濾液900μl，37℃水浴氮?dú)獯蹈?，固體殘留物于-20℃低溫冷凍保存，測(cè)定前取出備用。固體殘留物用100μl流動(dòng)相溶解，渦旋混勻，12000rpm離心5min，取20μl進(jìn)樣分析。
　　 結(jié)果:
　　 該分析方法的檢測(cè)限

3、為1μg·ml-1，定量限為5μg·ml-1。重復(fù)性和穩(wěn)定性考察RSD％值均小于3.91;提取回收率的RSD％值小于3.67。符合生物樣品分析方法的限度要求。
　　 結(jié)論:
　　 本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定大鼠血清中膽酸類(lèi)含量的HPLC-ELSD法，該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，樣品處理方法簡(jiǎn)單、快捷，為藥代動(dòng)力學(xué)及血清藥物化學(xué)的研究提供了檢測(cè)技術(shù)。
　　 第二部分:
　　 天然牛黃與酶促牛黃膽酸類(lèi)成分的血清中移行成分
　

4、　 目的:
　　 對(duì)灌胃給藥天然牛黃與酶促牛黃的大鼠血清進(jìn)行HPLC-ELSD、HPLC-MS分析，確認(rèn)二者的入血成分和血中移行成分，從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面論證酶促牛黃替代天然牛黃的可行性。
　　 方法:
　　 (1)色譜柱:AgelaVenusilMPC18(4.6mm×250mm，5μm)柱;流動(dòng)相:乙腈(A)，0.2％甲酸水(B)，梯度洗脫，0min為30％A、70％B，15min為55％A、45％B，30m

5、in90％A、10％B;流速:1.0ml·min-1;柱溫:25℃;檢測(cè)器:蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。ELSD檢測(cè)器:漂移管溫度85℃;氮?dú)饬魉?.0L·min-1;ImpactOFF。(2)質(zhì)譜條件。離子源:ESI源;檢測(cè)方式:負(fù)離子檢測(cè);掃描方式:全離子掃描(SCAN);掃描范圍:100-1500amu;毛細(xì)管電壓:4.0kV（正、負(fù)離子），碎裂電壓:150V;源溫度:99℃;去溶劑氣:N2;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流速:9L·min-

6、1;干燥氣壓力:35psig。(3)血清樣品預(yù)處理:取血清100μl，加入甲醇900μl，渦旋混勻，12000rpm離心5min;取上清液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾;取濾液900μl，37℃恒溫水浴氮?dú)獯蹈?，固體殘留物于-80℃低溫冷凍保存，測(cè)定前取出備用。固體殘留物用100μl流動(dòng)相溶解，渦旋混勻，12000rpm離心5min，取20μl進(jìn)樣分析。
　　 結(jié)果:
　　 Wistar大鼠灌胃天然牛黃、酶促牛黃穩(wěn)態(tài)含藥血清

7、樣品圖譜與空白血清HPLC-ELSD圖譜相比較，確認(rèn)給藥天然牛黃后血中出現(xiàn)了10個(gè)移行成分，其中可以確定的成分為鵝去氧膽酸和去氧膽酸;給藥酶促牛黃后血中出現(xiàn)了7個(gè)移行成分，已知成分為鵝去氧膽酸。
　　 結(jié)論:
　　 在天然牛黃灌胃給藥的大鼠血清中發(fā)現(xiàn)10個(gè)入血成分，兩個(gè)已知入血成分去氧膽酸和鵝去氧膽酸。酶促牛黃灌胃給藥的大鼠血清中發(fā)現(xiàn)7個(gè)入血成分，已知入血成分為鵝去氧膽酸。酶促牛黃和天然牛黃發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)存在差異。<

8、br>　　 第三部分:
　　 牛黃中去氧膽酸與酶促牛黃中鵝去氧膽酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　 目的:
　　 通過(guò)所建立的膽酸類(lèi)成分定量分析方法測(cè)定灌胃給藥牛黃后，膽酸類(lèi)成分在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，應(yīng)用3P97軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，旨在研究牛黃中所含膽酸類(lèi)成分在動(dòng)物體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)行為，為牛黃與酶促牛黃開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只。分組灌胃

9、單次給天然牛黃4.0g·kg-1、2.0g·kg-1，酶促牛黃3.8g·kg-1、2.0g·kg-1。給藥后5min、10min、20min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、9h于尾尖取血約0.5ml。(2)取血清100μl，加入甲醇900μl，渦旋混勻，12000rpm離心5min;取上清液，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾;取濾液900μl，37℃水浴氮?dú)獯蹈桑腆w殘留物用100μl流動(dòng)相溶解，渦旋混勻，12000rp

10、m離心5min，取20μl進(jìn)樣分析，酶促牛黃組測(cè)定鵝去氧膽酸含量，天然牛黃組測(cè)定去氧膽酸含量。(3)采用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行自動(dòng)擬合處理，以最佳房室模型為標(biāo)準(zhǔn)分別計(jì)算每只大鼠的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并求出均值，利用統(tǒng)計(jì)矩法求算AUC及MRT值，并求算各劑量的絕對(duì)生物利用度。
　　 結(jié)果:
　　 (1)大鼠灌胃給天然牛黃后，去氧膽酸T(peak)約為0.72h，T1/2Ka約為0.16h，兩種劑量條件下的分布相半衰期T1/2

11、α約為1.4h，消除半衰期T1/2β約為6h;表觀(guān)分布系數(shù)V/F均較小。兩劑量組的去氧膽酸在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間MRT(0～∞)和MRT(0～t)沒(méi)有明顯差異，而AUC(0～∞)和AUC(0～t)差異顯著，AUC與劑量呈正相關(guān)。(2)大鼠灌胃給酶促牛黃后，鵝去氧膽酸T(peak)約為0.78h，T1/2Ka約為0.35h，兩種劑量條件下的分布相半衰期T1/2α約為0.9h、消除半衰期T1/2β約為6h，表觀(guān)分布系數(shù)V/F高劑量明顯大于低劑