EB病毒GPCR蛋白BILF1調(diào)控ICAM-1表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 G蛋白偶聯(lián)受體(GProtein-CoupledReceptor，GPCR)是一個龐大的受體家族，通過G蛋白與效應(yīng)分子偶聯(lián)，完成跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，實現(xiàn)多種生理或藥理效應(yīng)。除真核生物外，許多病毒所編碼的病毒蛋白也具有GPCR的特征，如具有7次疏水跨膜區(qū)域、氨基末端存在糖基化位點、胞內(nèi)區(qū)存在磷酸化位點，氨基末端及胞外環(huán)中存在保守的半胱氨酸等。許多體內(nèi)外研究提示，病毒所編碼的GPCR蛋白對病毒復(fù)制以及病毒在自然宿主中所誘導(dǎo)的

2、病理生理效應(yīng)具有重要調(diào)控作用。例如，鼠巨細(xì)胞病毒GPCR蛋白M33的缺陷將導(dǎo)致病毒不能播散至感染鼠的唾液腺部位;同時相對于野生型病毒，M33缺陷性的鼠巨細(xì)胞病毒對免疫功能底下小鼠的毒性更低;而該病毒另一種GPCR基因-M78的缺陷使鼠巨細(xì)胞病毒無論是在免疫功能健全還是免疫功能底下的小鼠中，都以一更低的水平復(fù)制和/或播散。γ2-皰疹病毒亞科的卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)編碼的G蛋白偶聯(lián)受體ORF74也被認(rèn)為在卡波氏肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程

3、中起著關(guān)鍵作用。
　　 隸屬于γ-皰疹病毒亞科的EB病毒亦編碼一種GPCR蛋白-BILF1，BILF1是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的EB病毒GPCR蛋白。迄今為止，Pubmed僅收錄5篇有關(guān)BILF1的文獻(xiàn)。這些研究顯示，BILF1屬于一新型G蛋白偶聯(lián)受體的亞家族，定位于漿膜系統(tǒng)，組成性激活Gai蛋白并借助其傳遞生物信號;BILF1還可通過下調(diào)MHCI類分子在宿主細(xì)胞膜表面的表達(dá)，在病毒免疫逃逸過程中發(fā)揮極其重要的作用。具有GPCR活性的B

4、ILF1是EB病毒的立早蛋白之一，已知其調(diào)控ERK，NF-кB等多條信號通路，參與病毒的裂解性復(fù)制，而它對宿主細(xì)胞更多調(diào)控作用機(jī)制有待進(jìn)一步發(fā)掘。
　　 EB病毒在人群中廣泛感染(90-95％)，其感染的一個重要特征是病毒能在機(jī)體能完成反復(fù)多次的潛伏——裂解期轉(zhuǎn)換。EBV潛伏在外周血的記憶性B細(xì)胞中，當(dāng)遇到特定信號的刺激，潛伏在記憶性B細(xì)胞中的EBV被激活，釋放出的病毒最終在口咽部上皮細(xì)胞中發(fā)生爆發(fā)性復(fù)制?？梢姡瑪y帶EBV的B細(xì)

5、胞在循環(huán)系統(tǒng)中游走、遷移、最后在效應(yīng)部位定居和大量復(fù)制。EBV在機(jī)體中的生活史依賴于細(xì)胞粘附分子的作用。同時EBV能轉(zhuǎn)化B細(xì)胞與B細(xì)胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等多種腫瘤有關(guān)。而許多粘附分子介導(dǎo)了腫瘤的惡性行為。
　　 細(xì)胞間粘附分子(intercellularadhesionmolecule)ICAM-1以其介導(dǎo)異質(zhì)粘附的功能受到研究人員的關(guān)注。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，是調(diào)節(jié)異質(zhì)黏附的重要因素，它在一些惡性腫瘤，如惡性黑色

6、素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、腎癌等腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。我們在研究中發(fā)現(xiàn)BILF1可在蛋白水平上調(diào)ICAM-1分子的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，我們設(shè)計了相關(guān)實驗，進(jìn)一步分析BILF1對ICAM-1表達(dá)調(diào)控作用及機(jī)制。
　　 目的：
　　 分析EB病毒立早蛋白BILFI對細(xì)胞間粘附分子ICAM-1表達(dá)的上調(diào)作用，并初步探討其調(diào)控信號及機(jī)制。
　　 方法：
　　 首先，我們在人B淋巴瘤細(xì)胞系Raji中

7、構(gòu)建了TPA/SB誘導(dǎo)EBV激活的細(xì)胞模型并分析了BILF1在EBV激活過程中的表達(dá)模式。我們同時構(gòu)建了BILFI的真核表達(dá)載體并通過電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)外源轉(zhuǎn)入BILF1，應(yīng)用Westembolt、Real-timePCR、雙熒光素酶報告載體實驗和特異性siRNA干擾技術(shù)，分別在蛋白水平和mRNA水平分析了BILF1對細(xì)胞間粘附分子ICAM-1表達(dá)水平的影響并分析其調(diào)控機(jī)制。為進(jìn)一步分析BILFl蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)EKT結(jié)構(gòu)域與BILF1生物學(xué)

8、功能之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了BILFI-K122A突變體，并通過Westembolt、雙熒光素酶報告載體實驗和免疫熒光技術(shù)，在蛋白水平、mRNA水平及亞細(xì)胞定位等方面進(jìn)一步探討B(tài)ILFI的功能與作用方式。
　　 結(jié)果：
　　 研究結(jié)果顯示，BILF1是EBV立早蛋白之一，在TPA/SB誘導(dǎo)的EBV激活模型中，BILF1表達(dá)模式與立早轉(zhuǎn)錄因子Zta的表達(dá)完全一致;過表達(dá)BILF1在mRNA和蛋白水平上調(diào)粘附分子ICAM-l分

9、子的表達(dá);BILF1可激活I(lǐng)CAM-1的啟動子活性，提示BILF1調(diào)控了ICAM-1的轉(zhuǎn)錄。NF-кB和AP-1是ICAM-1啟動子上重要的反應(yīng)元件。通過報告載體分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)BILFI可直接上調(diào)AP-l和NF-кB報告載體活性，且對AP-1的激活更顯著，呈劑量依賴性。提示BILF可能通過激活NF-кB和AP-1上調(diào)ICAM-1啟動子活性，從而影響ICAM-1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。進(jìn)一步通過WB分析實驗觀察到過表達(dá)BILF1在上調(diào)ICAM-I表

10、達(dá)的同時誘導(dǎo)p65的磷酸化，上調(diào)NF-кB靶基因Bcl-XL和IкBα表達(dá)，同時上調(diào)AP-1成員c-Jun磷酸化和c-fos水平。用MEKl抑制劑阻斷ERK通路的活化，觀察到BILFI的AP-1的激活和ICAM-I的上調(diào)作用只是部分受到的影響。提示BILF1對ICAM-1的上調(diào)作用依賴于其它通路。BILF1的GPCR活性依賴于其分子中的EKT結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了EKT功能缺陷的BILF1突變體K122A，通過報告載體活性分析及WB實驗觀察

11、到EKT功能域缺陷后部分的抑制了BILF1對AP-1的激活，提示BILF1對AP-1的激活部分依賴于‘EKT結(jié)構(gòu)域。最后我們通過，RNA干擾實驗結(jié)果證實，特異性敲低BILF1可抑制EBV激活所誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 具有GPCR活性的EB病毒立早蛋白BILF1可在mRNA和蛋白水平上調(diào)細(xì)胞間粘附分子ICAM-1表達(dá)，這一效應(yīng)主要是通過不完全依賴于ERK的AP-1信號通路實現(xiàn)的。BILF1上調(diào)IC