來(lái)氟米特對(duì)HMGB-1誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性系統(tǒng)性炎癥疾病,隨著免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,致殘率已顯著下降,但心血管疾病作為其遠(yuǎn)期并發(fā)癥已經(jīng)成為RA患者的首要死亡原因,其中早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)占有較高的比率。目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,多種細(xì)胞因子與單核/巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞之間形成的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的全過(guò)程。因此研究細(xì)胞因子在RA患

2、者動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中的作用具有重要的臨床價(jià)值。
　　 高遷移率族蛋白(high mobility group box protein HIMGB)-1是RA發(fā)病過(guò)程中重要的炎癥因子。HMGB-1還可激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,說(shuō)明HMGB-1與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān),但其機(jī)制尚不十分明確。Toll樣受體4(toll like receptor4,TLR4)是一類細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)跨膜受體,HMGB-1的受體之一

3、,它可通過(guò)多種途徑影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成。那么,HMGB-1是否通過(guò)與受體TLR4的結(jié)合影響了內(nèi)皮細(xì)胞功能而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展呢?
　　 臨床研究顯示,早期應(yīng)用慢作用藥物可以降低RA患者心血管疾病的發(fā)病率。來(lái)氟米特(leflunomide,LEF)屬慢作用藥物的一種,具有抗炎及免疫抑制作用。它可以通過(guò)改善脂質(zhì)代謝而降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。但尚未見(jiàn)LEF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的研究報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)即采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法,觀察HM

4、GB-1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVEC)功能的影響及來(lái)氟米特對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用,并探討其可能機(jī)制,為RA患者早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng),其中含10％胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L,鏈霉素。MTT檢測(cè)不同濃度LEF對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,按MTT結(jié)果將細(xì)

5、胞分為正常對(duì)照組,HMGB-1刺激組(10ng/ml),HMGB-1分別加10μg/ml、20μg/ml、40μg/mlLEF干預(yù)組。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blotting檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)-1蛋白的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞ICAM-1和TLR4 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1 不同濃度LEF對(duì)HMGB-1誘導(dǎo)

6、的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 MTT結(jié)果顯示,LEF呈濃度依賴性抑制HMGB-1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖,2.5μg/ml及5μg/ml LEF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率很低,160μg/ml的LEF24h的抑制率可達(dá)82％。
　　 2 HUVEC細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)情況
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,ICAM-1蛋白陽(yáng)性顆粒主要表達(dá)于細(xì)胞漿中,呈棕黃色顆粒。正常對(duì)照組可見(jiàn)少量表達(dá),HMGB-1刺激后細(xì)胞的ICAM-

7、1蛋白表達(dá)顯著增加。而LEF干預(yù)組的ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較HMGB-1組降低,隨著LEF濃度的增加,ICAM-1蛋白的表達(dá)逐漸減弱。
　　 Western blowing結(jié)果顯示,HMGB-1刺激24h后HUVEC細(xì)胞ICAM-1表達(dá)明顯升高,與正常對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。LEF干預(yù)組ICAM-1蛋白表達(dá)與HMGB-1組相比表達(dá)下降,并隨LEF濃度的增加而逐漸降低。
　　 3 HUVEC細(xì)胞I

8、CAM-1 mRNA的表達(dá)情況
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,HMGB-1刺激細(xì)胞后可以明顯上調(diào)ICAM-1 mRNA的表達(dá),與對(duì)照組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。LEF組ICAM-1表達(dá)明顯下降,以40μg/ml LEF組為著,與HMGB-1組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 4 HUVEC細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)情況
　　 RT-PCR結(jié)果表明,正常細(xì)胞中TLR4 mRNA的表

9、達(dá)量很少,HMGB-1可明顯上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)。應(yīng)用LEF干預(yù)24h后TLR4的表達(dá)呈濃度依賴性下降,以40μg/ml LEF組為著,與HMGB-1組比較差異有顯著意義(P＜0.01)。
　　 5 相關(guān)性分析
　　 經(jīng)pearson相關(guān)分析,ICAM-1mRNA與TLR4 mRNA的表達(dá)水平之間呈顯著正相關(guān)(r=0.977,P=0.004)。
　　 結(jié)論:
　　 1 HMGB-1通過(guò)上調(diào)