EB病毒LMP1通過(guò)p53調(diào)控survivin的分子機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤的形成是細(xì)胞調(diào)節(jié)通路及其網(wǎng)絡(luò)整體紊亂的結(jié)果。與正常細(xì)胞相比，往往一些通路處于異常激活狀態(tài)，而有些通路卻傳遞受阻。因此，在腫瘤中，增殖失控、凋亡受阻及侵襲與轉(zhuǎn)移等都是常見(jiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常的結(jié)果。 EB病毒是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)的DNA致瘤病毒。EB病毒的感染與人類的Burkitt's淋巴瘤、何杰金氏病、鼻咽癌、肺癌、胃癌和乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，鼻咽癌與EB病毒的關(guān)系最為密切。其中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1是重要的

2、致瘤蛋白，以鼻咽癌為切入點(diǎn)，我們多年的研究工作一直致力于LIVlP1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。LMP1通過(guò)NF-kB、AP-1、JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其之間的cross-talk作用于下游眾多的調(diào)節(jié)基因，其中包括抗凋亡基因survivin和細(xì)胞周期表達(dá)相關(guān)基因p53從而參與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡等多種生物學(xué)功能。 Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白IAPs(Inhibitor ofApoptosis Prote

3、in)家族的新成員，與其他IAP家族成員不同的是，它在正常分化的成人組織中很少表達(dá)，但在胚胎和發(fā)育的胎兒組織以及大多數(shù)的腫瘤組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中高度表達(dá)。Survivin分子結(jié)構(gòu)中的BIR(Baculovirus IAP Repeat)與其抑制凋亡的功能密切相關(guān)。Survivin在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)具有嚴(yán)格的細(xì)胞周期依賴性，在G2/M期特異性表達(dá)，它具有調(diào)控細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用。Survivin的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)CDC2/Cycli

4、nB1特異性的磷酸化位點(diǎn)，它位于survivinThr34，這個(gè)磷酸化位點(diǎn)對(duì)于survivin與多聚微管/有絲分裂紡錘體的相關(guān)性，以及在有絲分裂期survivin抑制caspase-9的活性是必需的。同時(shí)，survivin也可通過(guò)移位于核與CDK4結(jié)合促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)換。從而提示，survivin不僅對(duì)G2/M期具有調(diào)控功能，同時(shí)，在對(duì)G1/S期的調(diào)控中也具有重要的生物學(xué)意義。Survivin抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制是非常復(fù)雜的，它可以通過(guò)

5、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用以及線粒體的動(dòng)力學(xué)等多種方式實(shí)現(xiàn)。 我們的工作證實(shí)LMP1能夠通過(guò)活化NF-kB和AP-1介導(dǎo)抗凋亡蛋白survivin的異常激活。LMP1表達(dá)介導(dǎo)survivin核移位，促進(jìn)細(xì)胞Rb磷酸化增加，導(dǎo)致S期演進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞周期行進(jìn)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖；LMP1能夠同時(shí)促進(jìn)survivin和CDK4的表達(dá)以及二者移位于核，并且能夠介導(dǎo)兩者的結(jié)合，這對(duì)于G1/S期的演進(jìn)具有重要作用。LMP1通過(guò)su

6、rvivin介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制。Survivin反義核酸可抑制survivin表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果為我們進(jìn)一步探討EBV-LMP1介導(dǎo)survivin促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤中都存在有survivin的過(guò)度表達(dá)和野生型p53的缺失或突變。p53基因的突變可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一條或多條信號(hào)通路刺激survivin的表達(dá)。野生型p53(wt-p53)可以在轉(zhuǎn)

7、錄水平抑制survivin表達(dá)。在survivin啟動(dòng)子上有p53結(jié)合位點(diǎn)。p53可以直接結(jié)合到survivin的啟動(dòng)子上，還可通過(guò)與其他蛋白，如E2F，sin3和HDAC等形成復(fù)合物結(jié)合到survivin啟動(dòng)子上從而抑制survivin的表達(dá)。p53還可以直接結(jié)合到cdc2/cyclinB1的催化亞基上，通過(guò)抑制cdc2/cyclinB1激酶的活性，使細(xì)胞內(nèi)survivin的磷酸化水平下調(diào)。同時(shí)，survivin也可通過(guò)caspase

8、/Mdrn2以及AuroraB對(duì)p53在蛋白水平上進(jìn)行調(diào)控。 p53基因作為重要的抑癌基因，人類腫瘤中約50％以上與p53基因變化有關(guān)。p53是一種核內(nèi)磷酸化蛋白，是細(xì)胞生長(zhǎng)周期中負(fù)調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)功能有關(guān)。但與其他腫瘤不同的是，鼻咽癌中p53基因的突變頻率很低(<10％)，且出現(xiàn)了p53蛋白積聚的現(xiàn)象。許多研究表明p53在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是具有活性的。 我們

9、的前期研究發(fā)現(xiàn)，永生化鼻咽上皮NP69細(xì)胞模型中存在大量游離的野生型的p53，并且其中p53是具有活性的，LMP1能在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平調(diào)節(jié)p53的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)LMP1可通過(guò)MAPK(Mitosis active protein kinase)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)p53多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，并促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄活性、反式激活能力以及降低p53與MDM2的結(jié)合能力，從而促進(jìn)LMP1對(duì)p53活性和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。同時(shí)，我們?cè)谄渌茄拾┘?xì)胞模型中的研究

10、工作也證實(shí)LMP1可通過(guò)活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和AP-1上調(diào)p53蛋白的表達(dá)及其反式激活活性，降低cdc2/cyclinB1復(fù)合物的激酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2/M期，但未有凋亡的發(fā)生。 因此，我們假設(shè)，在鼻咽癌細(xì)胞中，LMP1有可能通過(guò)調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控survivin。我們?cè)趐53外顯子8突變的的鼻咽癌細(xì)胞系(CNEl，CNE1-LMP1)和含野生型p53的永生化鼻咽細(xì)胞系(NP69，NP69-pLNSX，NP

11、69-LMP1)中，通過(guò)Western blotting技術(shù)結(jié)合阻斷策略檢測(cè)細(xì)胞中p53基因沉默前后survivin 的蛋白水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在p53外顯子8突變的鼻咽癌細(xì)胞模型還是在含野生型p53的鼻咽細(xì)胞模型中，LMP1均可上調(diào)p53和survivin的蛋白水平及其活性；在LMP1調(diào)控下，轉(zhuǎn)染p53siRNA質(zhì)粒后，survivin的蛋白水平也呈明顯下調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)了我們的假設(shè)，即LMP1可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子p53上調(diào)surv

12、ivin。結(jié)合上述研究進(jìn)展及我們的工作基礎(chǔ)，我們認(rèn)為L(zhǎng)MP1通過(guò)p53上調(diào)survivin與p53外顯子8突變無(wú)關(guān)。 進(jìn)一步，我們對(duì)LMP1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子p53調(diào)控survivin的分子機(jī)制進(jìn)行探討。轉(zhuǎn)錄水平上，我們從p53對(duì)survivin基因反式調(diào)控以及p53和survivin基因DNA結(jié)合能力兩方面，主要采用報(bào)告基因分析、電泳凝膠遷移率改變(EMSA)等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合阻斷策略，探討在LMP1調(diào)控下，p53對(duì)survi

13、vin基因的調(diào)控。報(bào)告基因結(jié)果顯示，LMP1可以明顯上調(diào)survivin基因的啟動(dòng)子活性，但在阻斷p53基因表達(dá)之后，survivin基因的啟動(dòng)子活性明顯下降，這提示LMP1可以通過(guò)p53上調(diào)survivin基因啟動(dòng)子的活性。EMSA結(jié)果也顯示，LMP1可以促進(jìn)p53和survivin基因DNA的結(jié)合能力，但在阻斷p53基因表達(dá)之后，二者結(jié)合能力明顯下降。 同時(shí)，我們還從p53和survivin的細(xì)胞定位以及二者在蛋白水平的結(jié)合

14、能力，采用免疫熒光，胞漿胞核Western blot分析和免疫共沉淀的方法，探討LMP1調(diào)控下，p53對(duì)survivin在蛋白水平的調(diào)控。免疫熒光和胞漿胞核Western blot結(jié)果表明，LMP1可以促進(jìn)p53和survivin的核移位；免疫共沉淀結(jié)果表明，p53和survivin可以在蛋白水平相互作用，但在LMP1陰性和陽(yáng)性的細(xì)胞中無(wú)明顯差異。上述結(jié)果提示我們，LMP1通過(guò)p53上調(diào)survivin可能主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。

15、此外，我們還通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)LMP1通過(guò)p53上調(diào)survivin對(duì)細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行了初步探討。我們發(fā)現(xiàn)，阻斷p53基因表達(dá)后，細(xì)胞的凋亡率增加，這是因?yàn)閟urvivin的表達(dá)下調(diào)，其抑制凋亡功能也降低所致。從而更進(jìn)一步證實(shí)了p53在鼻咽癌細(xì)胞中的功能主要不是發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用。 本課題首次發(fā)現(xiàn)了在鼻咽癌細(xì)胞中LMP1可以通過(guò)p53上調(diào)survivin，即LMP1可以通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子p53上調(diào)survivin基因的啟動(dòng)子活性，