EB病毒潛伏膜蛋白LMP1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3調(diào)控cyclin D1基因的分子機(jī)制研究.pdf

1、本室的前期研究首先發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞中LMP1通過(guò)其CTAR1募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子精細(xì)調(diào)控EGFR表達(dá)和上調(diào)EGFR磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，繼首次發(fā)現(xiàn)LMP1可以調(diào)控EGFR核移位，并呈EGF配體非依賴性。據(jù)報(bào)道用EGF刺激細(xì)胞后應(yīng)用激光共聚焦檢查觀察，10分鐘即可細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)核EGFR的存在。同時(shí)，不少作者認(rèn)為EGFR需與其他能直接結(jié)合于靶基因DNA的轉(zhuǎn)錄因子相互作用方能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用。為觀察在LMP1調(diào)控下

2、轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3在鼻咽癌細(xì)胞核內(nèi)是否存在共定位，選擇激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，以LMP1陰性表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞CNE1細(xì)胞為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在LMP1陽(yáng)性表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1細(xì)胞內(nèi)存在EGFR和STAT3蛋白的共定位；應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測(cè)，顯示LMP1可調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3呈復(fù)合物結(jié)合；再分別用胞漿和核蛋白做免疫共沉淀及western-blot檢測(cè)表明EGFR和STAT3復(fù)合物結(jié)合的主

3、要亞細(xì)胞定位是細(xì)胞核。
　　 為探討LMP1調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR/STAT3作用的靶基因是否是cyclin D1基因，以LMP1表達(dá)陰性的鼻咽癌細(xì)胞CNE1和LMP1陽(yáng)性表達(dá)的CNE1-LMP1細(xì)胞為模型，采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法將cyclin D1報(bào)道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CNE1、CNE1-LMP1細(xì)胞系后，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析。同時(shí)利用特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1阻斷LMP1的表達(dá)后，進(jìn)行報(bào)告基因分析，發(fā)現(xiàn)CNE1-LMP

4、1細(xì)胞的cyclin D啟動(dòng)子活性明顯高于CNE1，轉(zhuǎn)染了特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1的CNE1-LMP1細(xì)胞系的報(bào)告基因活性顯著低于未經(jīng)DZ1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果提示了LMP1能夠有效地分別調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3反式激活cyclinD1的活性。進(jìn)一步通過(guò)小干擾RNA沉寂靶基因RNA策略，將EGFRsiRNA，STAT3siRNA分別和共同與cyclinD1報(bào)道質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染CNE1-LMP1細(xì)胞后，進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)，并

5、與加入非特異性siRNA的對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)前組各自的cyclinD1報(bào)道基因活性都明顯降低，T’檢驗(yàn)，P值<0.05，差異有顯著性意義；共轉(zhuǎn)染EGFRsiRNA和STAT3siRNA組的cyclinD1報(bào)道基因活性比各單獨(dú)轉(zhuǎn)染組更降低。提示不論獨(dú)立或同時(shí)沉寂cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)EGFR和STAT3mRNA均可降低LMP1調(diào)控的cyclinD1啟動(dòng)子活性，從另一方面證明LMP1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3調(diào)節(jié)cyclin D1啟動(dòng)

6、子活性。為探討LMP1是否可經(jīng)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR/STAT3而調(diào)節(jié)cyclin D1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)GeneBank和Primer3引物設(shè)計(jì)軟件搜索和設(shè)計(jì)合成人Cyclin D1的cDNA引物序列進(jìn)行了real-time PCR檢測(cè)，經(jīng)分別轉(zhuǎn)染EGFRsiRNA和STAT3siRNA與非特異性對(duì)照siRNA于CNE1-LMP1細(xì)胞，提取其mRNA進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)，顯示LMP1可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子EGFR、STAT

7、3對(duì)CyclinD1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行不同程度的調(diào)節(jié)；但是同時(shí)沉寂EGFR、STAT3轉(zhuǎn)錄因子并未顯示其抑制作用強(qiáng)于兩轉(zhuǎn)錄因子的分別沉寂的抑制作用，表現(xiàn)了CyclinD1mRNA表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。
　　 文獻(xiàn)報(bào)道大量的細(xì)胞膜受體可以核移位，如EGFR，HER-2，F(xiàn)GFR，HER-3。膜受體核移位后如何作用于靶基因的分子機(jī)制至今尚未完全明了。據(jù)報(bào)道EGFR核移位后能識(shí)別并結(jié)合至cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)富含AT的保守序列并反式

8、激活cyclinD1基因的表達(dá)，但并未研究清楚EGFR是否能直接結(jié)合于cyclinD1啟動(dòng)子ATRS；另有作者認(rèn)為EGFR缺乏DNA結(jié)合域，需與其他能直接結(jié)合于DNA的轉(zhuǎn)錄因子相互作用方能發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的生物學(xué)作用。激活后的STAT3即可核移位，通過(guò)識(shí)別靶基因上STAT3特異性的DNA結(jié)合成分而與其結(jié)合，并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。有作者發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性需要募集共活化子共同作用，如需與EGFR共同靶向iNOS啟動(dòng)子才能最大程度地促

9、進(jìn)iNOS基因表達(dá)。鼻咽癌細(xì)胞cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)是否存在EGFR與STAT3共結(jié)合DNA序列，LMP1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3調(diào)控cyclin D1轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制是通過(guò)對(duì)cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)EGFR、STAT3各自獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)或EGFR/STAT3共結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮生物調(diào)控作用?首先分析LMP1通過(guò)誘導(dǎo)EGFR、STAT3分別與cyclinD1基因啟動(dòng)子區(qū)各自的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并反式激活作用，通過(guò)電泳遷移率變動(dòng)分析，并且基

10、于己證實(shí)的某些小分子抑制劑可阻斷LMP1誘導(dǎo)EGFR/STAT3的主要磷酸化位點(diǎn)激活，而抑制其核移位的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，采用小分子阻斷策略觀察抑制EGFR/STAT3核移位后對(duì)其與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合能力的影響。結(jié)果顯示LMP1陽(yáng)性細(xì)胞核蛋白與生物素標(biāo)記野生型EGFR形成的結(jié)合帶明顯強(qiáng)于LMP1陰性表達(dá)細(xì)胞，提示LMP1能夠調(diào)控EGFR與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)EGFR結(jié)合位點(diǎn)DNA的結(jié)合。利用酪氨酸激酶小分子抑制劑AG1478阻斷EG

11、FR磷酸化途徑后，其與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合能力降低，表明酪氨酸激酶抑制劑AG1478能夠降低LMP1調(diào)控的EGFR與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合的能力，這從另一方面證實(shí)LMP1可調(diào)控EGFR與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LMP1能夠調(diào)控STAT3與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)STAT3結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力，利用小分子阻斷劑WHI-p131.PD98059，阻斷STAT3磷酸化后，可以降低STAT3與CyclinD

12、1啟動(dòng)子DNA結(jié)合能力，證實(shí)LMP1可調(diào)控STAT3與CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力。進(jìn)一步通過(guò)報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LMP1通過(guò)EGFR和STAT3誘導(dǎo)上調(diào)的cylinD1啟動(dòng)子活性能被EGFRTry1173位磷酸化，STAT3酪氨酸705位磷酸化和STAT3絲氨酸727位磷酸化的小分子阻斷劑分別不同程度地抑制。這些結(jié)果從正反兩方面證明了LMP1可通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3結(jié)合于cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)各自的結(jié)合位點(diǎn)而調(diào)節(jié)cy

13、clin D1啟動(dòng)子活性的作用機(jī)制。
　　 根據(jù)分子生物學(xué)信息技術(shù)及參考文獻(xiàn)，我們推測(cè)在cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)存在EGFR和STAT3共結(jié)合潛在的位點(diǎn)，分析其序列為TTCTATGAA。經(jīng)分析在CYCLIND1啟動(dòng)子區(qū)只有一個(gè)EGFR和STAT3潛在的共結(jié)合位點(diǎn)TTCTATGAA。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)PCR引物，采用CHIP、PCR及瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示CNE1-LMP1活體細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)存在EGFR、STAT

14、3結(jié)合的共結(jié)合序列；不能忽略的是CNE1細(xì)胞內(nèi)CyclinD1啟動(dòng)子區(qū)也存在與EGFR、STAT3結(jié)合的共序列，這個(gè)共序列的存在也可能是鼻咽癌細(xì)胞的共同生物結(jié)構(gòu)特征；通過(guò)設(shè)計(jì)并合成包含EGFR/STAT3共結(jié)合序列的生物素標(biāo)記探針，采用EMSA分析發(fā)現(xiàn)CNE1-LMP1細(xì)胞核蛋白與生物素標(biāo)記野生型探針結(jié)合能力顯著高于CNE1細(xì)胞，提示LMP1可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子STAT3和EGFR與cyclinD1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)共序列的結(jié)合能力。運(yùn)用

15、點(diǎn)突變?cè)瓌t將cyclin D1啟動(dòng)子報(bào)道基因質(zhì)粒推測(cè)的EGFR和STAT3共序列的部分關(guān)鍵核苷酸進(jìn)行點(diǎn)突變，使轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3不能與cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)的共結(jié)合序列結(jié)合，從而不能反式激活cyclinD1，再轉(zhuǎn)染CNE1和CNE1-LMP1細(xì)胞進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變后LMP1細(xì)胞cylin D1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，約1倍，t’檢驗(yàn)，P<0.05，差異有顯著性意義；而CNE1細(xì)胞點(diǎn)突變前后無(wú)明顯改變。這些結(jié)果表

16、明LMP1可以通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3結(jié)合至cyclinD1啟動(dòng)子區(qū)的其結(jié)合位點(diǎn)共序列，并通過(guò)該位點(diǎn)協(xié)同反式激活cyclinD1啟動(dòng)子的活性。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了在LMP1陽(yáng)性表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞核存在轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3的核移位和共定位，及LMP1可誘導(dǎo)EGFR/STAT3相互呈復(fù)合物結(jié)合并且其結(jié)合的主要部位為胞核；LMP1調(diào)控EGFR和STAT3作用的主要靶基因是cyclin D1；LMP1既可以通

17、過(guò)調(diào)控EGFR、STAT3結(jié)合于cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)各自的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)cyclin D1啟動(dòng)子活性，又可通過(guò)調(diào)控EGFR、STAT3結(jié)合于cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)EGFR/STAT3共結(jié)合序列而激活cyclin D1啟動(dòng)子。
　　 本項(xiàng)目首次觀察到LMP1可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3共定位于鼻咽癌細(xì)胞核，為L(zhǎng)MP1激活的轉(zhuǎn)錄因子EGFR和STAT3兩條不同的信號(hào)通路的整合提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的依據(jù)；也同樣首次發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)