肝細胞生長因子在豚鼠透鏡誘導性近視形成中的作用.pdf

1、近視是眼科的常見病、多發(fā)病,影響患者的學習、工作和生活,其發(fā)病率逐年上升,已經(jīng)成為嚴重的醫(yī)學社會問題。因此,近視的發(fā)病機制及其防治已成為全球關注的熱點。
　　 隨著分子生物學技術的發(fā)展,大量研究提示:異常視覺信息引起眼內多種生長因子及神經(jīng)遞質發(fā)生改變,通過一系列的信號轉導過程,導致鞏膜細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過多降解,鞏膜重塑,眼軸延長,形成近視。研究證實,近視形成過程中,鞏膜基質金屬蛋白酶

2、-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)表達明顯增強。MMP-2是降解鞏膜ECM最主要的酶,MMP-2表達增高極可能是近視眼中鞏膜重塑的直接原因。但MMP-2表達增高的具體原因尚不清楚。
　　 肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一種多功能的生長因子,其受體c-Met由原癌基因c-met編碼,具有酪氨酸激酶活性。HGF及其受體c-Met存在于多種組織和細胞

3、中。HGF與其受體c-Met結合后,可激活c-Met發(fā)生自體磷酸化,啟動下游信號轉導通路的級聯(lián)激活,從而調節(jié)多種組織器官的生長發(fā)育及多種病理過程。近年來大量研究顯示,HGF可在多種組織及細胞上調MMP-2的表達,導致ECM降解,發(fā)揮其抗纖維化的作用。最近,在小鼠眼球生長基因研究中發(fā)現(xiàn),HGF相關基因可能與眼球生長密切相關。而眼球的生長與近視形成有密切的關系,因此我們推測:HGF可能與近視的形成有關。
　　 c-Jun氨基末端激酶

4、(c-Jun N-terminal kinase,JNK)家族是1990年被發(fā)現(xiàn)的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen—activatedproteinkinase,MAPK)超家族成員之一,是成纖維細胞等細胞中多種信號從細胞表面向核內傳遞的共同途徑,屬于進化上保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶。以JNK為中心的JNK信號轉導通路可被生長因子、細胞因子及環(huán)境應激等刺激信號激活,從而調控下游基因的轉錄,在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。最近研

5、究顯示,JNK信號轉導通路可介導多種組織及細胞內MMP-2的表達增強,促進ECM降解,發(fā)揮抗纖維化等作用。
　　 鞏膜組織及細胞中有否HGF及c-Met的表達?近視眼鞏膜中HGF及c-Met表達是否增強?HGF能否上調鞏膜中MMP-2的表達?如果能,是通過JNK信號轉導通路的介導嗎?目前國內外文獻中尚未見相關報道。
　　 研究建立豚鼠透鏡誘導性近視模型,培養(yǎng)豚鼠鞏膜成纖維細胞,檢測近視形成過程中HGF及MMP-2的表達變

6、化；在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中,觀察HGF能否上調MMP-2的表達及JNK信號轉導通路在HGF上調MMP-2表達中的作用；玻璃體腔注射JNK信號轉導通路的特異性抑制劑SP600125,觀察其是否能抑制豚鼠透鏡誘導性近視的形成,從而探討HGF-JNK-MMP-2信號途徑在近視形成中的作用,為近視的防治提供新的思路。課題分以下3部分。
　　 目的：建立豚鼠透鏡誘導性近視模型,應用免疫組織化學、Western blot及RT-P

7、CR方法檢測正常塒照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met及MMP-2的mRNA及蛋白表達,以探討HGF與近視形成的關系。
　　 方法：
　　 1.動物模型的建立及分組:選用健康1周齡雄性花色豚鼠90只,隨機分為正常對照組和透鏡誘導組。對照組:30只豚鼠的雙眼不作任何處理,共60眼。透鏡誘導組:60只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.0D透鏡,共60眼。6周后,每組取20眼用于HE染色及免疫組化檢測,20眼用于RT-PCR檢測

8、,另20眼用于Western blot方法檢測。
　　 2.屈光度與眼軸長度測量:實驗前后以檢影鏡檢測豚鼠屈光狀態(tài),眼科A超測量眼軸長度。
　　 3.HE染色與形態(tài)學觀察:光學顯微鏡下觀察正常對照組及透鏡誘導組的形態(tài)學變化。
　　 4.免疫組化染色方法:檢測正常對照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表達。
　　 5.RT—PCR方法:檢測正常對照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met

9、及MMP-2的mRNA表達。
　　 6.Western blot方法:檢測正常對照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met、p-c-Met及MMP-2的蛋白表達。
　　 7.統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)均用(x)±s表示,統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,2組間比較采用配對t檢驗,眼軸長度與屈光度關系采用直線相關分析,取α=0.05作為檢驗水準。
　　 結果：
　　 1.屈光度與眼軸長度:與正常對照組比較,透

10、鏡誘導組形成了明顯近視:負屈光度明顯增加(P<0.05),眼軸明顯增長(P<0.05)。
　　 2.形態(tài)學變化:透鏡誘導組視網(wǎng)膜、脈絡膜及鞏膜均變薄,鞏膜膠原纖維變薄、排列稀疏、紊亂。
　　 3.免疫組化染色檢測:正常對照組鞏膜中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2蛋白呈低水平表達,鞏膜輕度著染呈淡黃色；透鏡誘導組鞏膜中HGF、MMP-2蛋白表達較正常對照組明顯增強(P<0.05),鞏膜組織著色呈棕黃色,2組中c-Me

11、t蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4.RT-PCR方法檢測:正常對照組鞏膜中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2mRNA低水平表達；透鏡誘導組鞏膜中HGF及MMP-2 mRNA表達較正常對照組明顯增強(P<0.05),而c-Met mRNA表達在2組中比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 5.Western blot方法檢測:正常對照組鞏膜中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低

12、水平表達,透鏡誘導組鞏膜中HGF、MMP-2蛋白表達較正常對照組明顯增強(P<0.05)。2組中總的c-Met蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但在透鏡誘導組中p-c-Met蛋白表達明顯增強(P<0.05)。
　　 6.HGF、p-c-Met及MMP-2蛋白在透鏡誘導組鞏膜中表達的相關性分析:在透鏡誘導組鞏膜中,HGF與p-c-Met,p-c-Met與MMP-2及HGF與MMP-2蛋白表達的相關系數(shù)分別是0.902

13、,0.885,0.900,P均<0.05,提示三者的蛋白表達兩兩相關。
　　 結論：
　　 1.透鏡誘導組鞏膜中,HGF表達增加,其受體c-Met磷酸化增強,提示:HGF可能參與透鏡誘導性近視的形成。
　　 2.透鏡誘導組鞏膜中,HGF、p-c-Met及MMP-2的蛋白表達增強且兩兩正相關,提示:HGF可能通過上調MMP-2的表達參與透鏡誘導性近視形成。
　　 目的：實驗前期研究發(fā)現(xiàn),HGF可能通過上調M

14、MP-2表達參與透鏡誘導性近視的形成和發(fā)展。進一步培養(yǎng)正常對照組及透鏡誘導組豚鼠鞏膜成纖維細胞,在體外檢測2組細胞中HGF、c-Met及MMP-2蛋白表達；用HGF及其siRNA處理鞏膜成纖維細胞,檢測MMP-2的mRNA及蛋白表達；并觀察JNK信號轉導通路在HGF調控MMP-2表達中的作用。從而探討HGF-JNK-MMP-2信號途徑在近視形成中的作用。
　　 方法：
　　 1.培養(yǎng)正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞:

15、將30只1周齡雄性花色豚鼠隨機分為正常對照組和透鏡誘導組。對照組:10只豚鼠的雙眼不作任何處理,共20眼。透鏡誘導組:20只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.0D透鏡,共20眼。4周后,處死豚鼠,體外培養(yǎng)正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞,觀察細胞形態(tài),并鑒定細胞類型。
　　 2.免疫細胞化學染色方法及Western blot方法檢測正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表達。
　　 3.

16、探討在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中,MMP-2是否為HGF的直接靶基因:
　　 3.1 MTT法檢測不同濃度(0.1ng／ml、1ng／ml、10ng／ml)的HGF對正常對照組鞏膜成纖維細胞增殖的影響。
　　 3.2 上述不同濃度的HGF作用于正常對照組鞏膜成纖維細胞,Western blot方法檢測細胞中p-c-Met的蛋白表達,RT-PCR及Western blot方法檢測MMP-2的mRNA及蛋白表達。選取不明

17、顯影響鞏膜成纖維細胞增殖、上調MMP-2表達作用明顯的HGF的濃度為10ng／ml,用于后續(xù)實驗。
　　 3.3 鑒于透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中內源性HGF基因表達較高,我們選擇其用于HGFsiRNA轉染。在透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中轉染HGF siRNA,Western blot方法檢測HGF蛋白表達,RT-PCR及Western blot方法檢測MMP-2 mRNA及蛋白表達。
　　 4. 探討在體外培養(yǎng)豚鼠鞏膜成纖

18、維細胞中,HGF上調MMP-2的表達是否通過JNK信號轉導通路介導:
　　 4.1 HGF(10ng／ml)作用于正常對照組鞏膜成纖維細胞,Western blot方法檢測JNK信號轉導通路的狀態(tài)及MMP-2蛋白表達的變化。
　　 4.2 MTT法檢測不同濃度(0.1μmol／L、1μmol／L、10μmol／L)的SP600125對正常對照組鞏膜成纖維細胞增殖的影響,選取10μmol／L為最佳濃度,用于后續(xù)實驗。

19、>　　 4.3 SP600125(10μmol／K)預處理后,HGF(10ng／ml)作用于正常對照組鞏膜成纖維細胞,Western blot方法檢測JNK信號轉導通路的狀態(tài)及MMP-2蛋白表達的變化。
　　 5. 統(tǒng)計學分析:所有數(shù)據(jù)均用(x)±s表示,統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,2組間比較采用配對t檢驗,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,取α=0.05作為檢驗水準。
　　 結果：

20、>　　 1. 培養(yǎng)的正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞生長良好,光鏡下觀察形態(tài)差異不明顯。2組細胞均表達波形蛋白,而不表達角蛋白,表明所培養(yǎng)細胞確實為成纖維細胞。
　　 2. 2組鞏膜成纖維細胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表達:
　　 2.1 免疫細胞化學染色方法:正常對照組鞏膜成纖維細胞中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表達,胞漿呈淡黃色著色；透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中HGF、MMP-2蛋

21、白表達較正常對照組明顯增強(P<0.05),胞漿呈棕黃色著色,2組細胞總c-Met蛋白表達Mol／L(P>0.05)。
　　 2.2 Western blot方法檢測:正常對照組鞏膜成纖維細胞中可檢測到.HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表達；透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中HGF、MMP-2蛋白表達較正常對照組明顯增強(P<0.05)；2組細胞總c-Met蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但透鏡誘導組鞏膜成纖維細

22、胞中c-Met蛋白磷酸化明顯增強(P<0.05)。
　　 3. 在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中:
　　 3.1 不同濃度的HGF(0.1ng／ml、1ng／ml、10ng／ml)對正常對照組鞏膜成纖維細胞干預72h后未見促進或抑制增殖能力的作用,與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3.2 在正常對照組鞏膜成纖維細胞中,HGF以劑量依賴的方式上調p-c-Met蛋白表達,隨后以劑量依賴的方式

23、上調MMP-2的mRNA及蛋白表達,各組間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.3 在透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中轉染HGF siRNA,HGF siRNA以時間依賴的方式抑制HGF蛋白表達,與空白對照組比較,72h后HGF蛋白表達明顯下降(P<0.05),同時MMP-2的mRNA及蛋白表達也明顯下降(P<0.05)。
　　 4. 在體外培養(yǎng)的豚鼠正常對照組鞏膜成纖維細胞中:
　　 4.1 HGF

24、(10ng／ml)可以激活細胞中JNK信號轉導通路,誘導JNK磷酸化增強,繼而引起MMP-2蛋白表達明顯上調(P<0.05)。
　　 4.2 不同濃度的SP600125干預細胞72h后,未表現(xiàn)出明顯促進或抑制增殖能力的作用,與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4.3 用SP600125(10μmol／L)預處理細胞后,HGF(10ng／ml)作用引起的JNK磷酸化和MMP-2蛋白表達上調均被明顯抑

25、制(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.透鏡誘導導致豚鼠鞏膜成纖維細胞內新的HGF蛋白合成以及MMP-2蛋白表達上調。
　　 2.在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中,HGF上調MMP-2的表達。
　　 3.在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中,HGF上調MMP-2的表達是通過JNK信號轉導通路來實現(xiàn)的。提示,HGF可能通過HGF-JNK-MMP-2信號途徑參與豚鼠透鏡誘導性近視形成。
　　 目的：

26、為了進一步在體內探討近視鞏膜中SP600125對JNK信號轉導通路及近視形成的抑制作用,研究首先建立豚鼠透鏡誘導性近視模型,采用玻璃體腔注射給藥的方式,進一步明確JNK信號轉導通路在近視形成中的作用及SP600125對近視的抑制作用。
　　 方法：
　　 1.動物模型的建立與分組:選用健康1周齡雄性花色豚鼠70只,隨機分成4組:Ⅰ組(透鏡誘導6周組)、Ⅱ組(透鏡誘導6周+PBS組)、Ⅲ組(透鏡誘導6周+SP600125(

27、10μmol／L)組)、Ⅳ組(正常對照組)。正常對照組10只豚鼠,取雙眼20眼為實驗眼；余每組20只豚鼠,均以右眼為實驗眼。
　　 2.屈光度及眼軸長度測量:同第1部分
　　 3.HE染色與形態(tài)學觀察:同第2部分
　　 4.Western blot方法:檢測各組豚鼠鞏膜組織中p-JNK和MMP-2的蛋白表達。
　　 5.統(tǒng)計學分析:同第1部分
　　 結果：
　　 1. 屈光度及眼軸長度:Ⅰ

28、組形成明顯的高度近視,負屈光度及眼軸長度均較Ⅳ組明顯增加(P均<0.05),Ⅲ組能部分抑制上述改變,而Ⅱ組則無明顯抑制作用。表明,SP600125(10μmol／L)部分抑制異常視覺信號引起的近視形成。
　　 2. HE染色與形態(tài)學觀察:Ⅰ組與Ⅳ組比較,后極部鞏膜明顯變薄,Ⅲ組能部分抑制上述鞏膜的改變,而Ⅱ組則無明顯抑制作用。
　　 3. Western blot方法檢測:Ⅰ組鞏膜組織p-JNK及MMP-2的蛋白表達較Ⅳ