肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在高血壓心肌纖維化中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景與目的: 高血壓靶器官損害是高血壓致死致殘的主要原因。心室重構(gòu)是高血壓最主要的靶器官損害之一。心肌纖維化是其中重要的病理改變，表現(xiàn)為心肌正常組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚、心臟組織中膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變，Ⅰ型膠原比例增加，從而使心肌僵硬度增加、順應(yīng)性降低、左室舒張功能減退。纖維化機(jī)制復(fù)雜，由多個(gè)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)。心臟局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因

2、子（hepatocyte growth factor，HGF）/c-Met 系統(tǒng)是調(diào)節(jié)心肌膠原的沉積和降解的重要因素。血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是RAS 主要的效應(yīng)分子，是重要的促纖維化因子。HGF 是一種多功能生長(zhǎng)因子，有促有絲分裂、細(xì)胞遷移和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的作用，能促進(jìn)血管生成、抑制心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌纖維化，是心血管系統(tǒng)的保護(hù)因子，與高血壓及心肌纖維化密切相關(guān)。近年來(lái)屢見報(bào)道HGF 在心肌缺血、心肌病等病

3、理模型中具抑制纖維化的作用，但對(duì)于其對(duì)原發(fā)性高血壓所致的心肌纖維化的作用及與RAS 的關(guān)系的研究很少，也未見關(guān)于HGF 對(duì)心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFbs）Ⅰ型膠原合成的影響及其機(jī)制的研究。本研究擬探討高血壓心肌纖維化病程中HGF 的作用，及其對(duì)CFbs 膠原合成的影響及機(jī)制。 方法: 1. 以自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertension rat，SHR）為高血壓心肌

4、纖維化模型，WKY 為對(duì)照。取8 周、12 周、16 周、24 周、32周雄性WKY 和SHR 大鼠各3 只，處死后取心臟組織制成石蠟切片。 另取4 周齡、16 周齡SHR 大鼠各6 只，分別隨機(jī)分成用藥組和對(duì)照組，用藥組給予每千克體重20mg 洛沙坦灌胃，一天一次。4 周齡大鼠處理至16 周，16 周齡大鼠處理至32 周后處死取心臟制成石蠟切片，分別代表早期和晚期治療。利用麥松（masson）三色法檢測(cè)心肌膠原含量，免疫組織化

5、學(xué)方法檢測(cè)心肌組織HGF 含量。利用LeicaQwin 彩色圖象分析系統(tǒng)分析以上masson 染色及免疫組化圖片，計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）及HGF 含量。 CVF=膠原面積/全視野組織面積，即膠原組織所占面積百分比；HGF含量=HGF 陽(yáng)性面積百分比×平均灰度值，陽(yáng)性面積百分比即陽(yáng)性斑塊面積占全視野組織面積百分比。通過比較各組CVF、HGF 含量變化，觀察高血壓心肌纖維化病

6、程的發(fā)生發(fā)展及RAS 與HGF 在此病程中的作用。 2. 原代培養(yǎng)SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞，用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/LAngⅡ分別孵育48h，以四氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，評(píng)價(jià)AngⅡ?qū)Fbs增殖的影響；用20ng/mlHGF和10-7 mol/L AngⅡ共同孵育CFbs 24h、48h，以MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，評(píng)價(jià)H

7、GF對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFbs增殖的影響。 3. 原代培養(yǎng)SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞，用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/LAngⅡ分別孵育48h，以蛋白免疫印跡方法檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白，評(píng)價(jià)AngⅡ?qū)FbsⅠ型膠原蛋白合成的影響；用0、1、10、20、40、100ng/mlHGF分別和10-7 mol/L AngⅡ共同孵育CFbs 48h，以蛋白免疫印跡方法檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白，評(píng)價(jià)HGF對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFbsⅠ

8、型膠原蛋白合成的影響。 4. 原代培養(yǎng)SD 大鼠心肌成纖維細(xì)胞，ERK1/2 阻斷劑PD98059、p38MAPK阻斷劑SB203580、JNK 阻斷劑SP600125 預(yù)處理后用AngⅡ和HGF 共同孵育48h，以蛋白免疫印跡方法檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白，評(píng)價(jià)ERK1/2、p38MAPK、JNK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HGF 抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFbsⅠ型膠原蛋白合成中的作用。 結(jié)果: 1. 比較各周齡組WKY 與SHR 大鼠

9、的CVF 發(fā)現(xiàn)：隨周齡增長(zhǎng)，兩組大鼠心肌膠原含量均增加。SHR 組自12 周起，WKY 自16 周起CVF顯著增加，自12 周始，SHR 組CVF 顯著高于同周齡WKY 組。 2. HGF 免疫組化結(jié)果顯示，隨著周齡增加，WKY 與SHR 組HGF 表達(dá)均降低。SHR 組自12 周起，WKY 組自16 周起，心肌組織HGF 含量顯著降低，自16 周始，SHR 組HGF 表達(dá)顯著低于同周齡WKY 組。 3. SHR 大鼠C

10、VF 隨周齡增長(zhǎng)而增加，而心肌組織HGF 含量隨周齡增長(zhǎng)而降低，CVF 與心肌組織HGF 含量呈負(fù)相關(guān)。 4. 以洛沙坦早期（4 周～16 周）或晚期（16～32 周）干預(yù)SHR 大鼠，發(fā)現(xiàn)治療后大鼠心肌膠原含量顯著低于同周齡SHR 大鼠，而HGF 含量顯著增加。 5. 用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L AngⅡ孵育CFbs 48h后，促進(jìn)CFbs增殖，在AngⅡ濃度高于10-7mol/L時(shí)

11、具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10-7mol/L AngⅡ 孵育24h或48h均能促進(jìn)CFbs增殖。HGF抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFbs增殖，孵育24h呈部分抑制作用，孵育48h后，差異顯著。 6. 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L AngⅡ 孵育CFbs 48 小時(shí)后，CFbsⅠ型膠原蛋白合成增加。濃度大于10-7mol/L時(shí)與對(duì)照組有顯著差異，但無(wú)劑量依賴性。HGF能部分抑制A

12、ngⅡ的作用,并呈劑量依賴性。 7. ERK1/2 通路阻斷劑PD98059、p38MAPK 通路阻斷劑SB203580、JNK通路阻斷劑SP600125 均能阻斷HGF 對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFbsⅠ型膠原蛋白合成的抑制作用。 結(jié)論: 1. SHR 大鼠CVF 隨周齡增長(zhǎng)而增加，與心肌組織HGF 含量負(fù)相關(guān)。洛沙坦干預(yù)可增加HGF 表達(dá)，降低CVF。提示高血壓心肌纖維化可能與心肌組織HGF 抗纖維化作用降低有關(guān)，A