紅花注射液抗血栓藥效物質(zhì)基礎(chǔ)初步研究.pdf

1、血栓性疾病包括血栓形成和血栓栓塞兩種病理過(guò)程所引起的疾病，又稱血栓栓塞性疾病。具有高發(fā)病、高復(fù)發(fā)、高致死、高致殘的特點(diǎn)。常見(jiàn)的深靜脈血栓、冠心病、心肌梗死、中風(fēng)、肺栓塞等多種嚴(yán)重疾病都屬于血栓性疾病，預(yù)計(jì)到2020年將成為全球第一大疾病，已引起了社會(huì)高度重視，并被認(rèn)為是當(dāng)今醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)難題之一。
　　紅花是用于治療心腦血管疾病的常用中藥。紅花注射液是通過(guò)水提、醇沉工藝制備的單方注射液，主要應(yīng)用于閉塞性腦血管病、冠心病和脈管炎等疾病

2、的預(yù)防和治療。經(jīng)過(guò)30余年的臨床應(yīng)用，證明療效確切，是目前國(guó)內(nèi)用于治療心腦血管疾病的首選中藥制劑之一。但要使其作為一種治療藥物更加合理廣泛的應(yīng)用，使其療效和安全性得到更加可靠的保證，并能為國(guó)際市場(chǎng)接受并具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的中藥制劑，還需要更深入的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)闡明其藥效物質(zhì)和作用機(jī)理。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅花注射液的研究主要集中在臨床觀察和藥理研究方面，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　在中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中，很重要的

3、一個(gè)環(huán)節(jié)是效應(yīng)成分篩選方法要體現(xiàn)出中藥療效作用的整體性、多靶點(diǎn)性和多成分協(xié)同作用的特點(diǎn)。血小板細(xì)胞固相萃取篩選法是依據(jù)生物活性細(xì)胞對(duì)效應(yīng)成分特異性結(jié)合原理，通過(guò)緩沖液多次洗滌排除非特異性結(jié)合成分，再對(duì)解離液成分分離分析來(lái)篩選出生物活性化合物。完整細(xì)胞保留了細(xì)胞上靶點(diǎn)的完整性、空間性、周?chē)h(huán)境及生物活性，且能夠特異性地、有選擇性地與活性成分結(jié)合，特別是細(xì)胞上的已知及未知的靶點(diǎn)都得到了表達(dá)，適合中藥作用多靶點(diǎn)的活性成分的分離與分析。

4、　　本研究通過(guò)將紅花注射液整體化學(xué)物質(zhì)拆分為子化學(xué)物質(zhì)組，利用藥理實(shí)驗(yàn)篩選有效化學(xué)物質(zhì)組;運(yùn)用血小板細(xì)胞固相萃取法篩選有效物質(zhì)組中與血小板結(jié)合效應(yīng)成分;并進(jìn)一步對(duì)效應(yīng)化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)與血小板結(jié)合效應(yīng)成分的藥理作用。采用層次化、系統(tǒng)化及逐步優(yōu)化的研究策略，從整體化學(xué)物質(zhì)組、有效化學(xué)物質(zhì)組、有效化學(xué)成分等不同層次逐步深入研究紅花注射液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本文研究主要分為以下幾個(gè)方面
　　1.選擇不同柱材料對(duì)紅花注射液進(jìn)

5、行分離，綜合HPLC圖譜及化學(xué)成分結(jié)構(gòu)相似原則，將紅花注射液整體化學(xué)物質(zhì)組拆分為5個(gè)子化學(xué)物質(zhì)組，ADP誘導(dǎo)血小板體外聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示組分第1，5具有較強(qiáng)抑制血小板聚集作用，第2組分具有較強(qiáng)的促進(jìn)血小板聚集作用，第3，4組分活性較弱。
　　2.采用血小板固相萃取結(jié)合HPLC實(shí)驗(yàn)篩選紅花水加醇提取物、紅花注射液有效化學(xué)物質(zhì)組2、組5中與血小板結(jié)合的效應(yīng)成分。在280nm，350nm，402nm紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下檢測(cè)，從紅花提取物中篩選出

6、10個(gè)與血小板結(jié)合的效應(yīng)成分，其中兩種鑒定為羥基紅花黃色素A或其同分異構(gòu)體及紅花黃色素B;從紅花注射液D-2組分中篩選出3個(gè)與血小板結(jié)合的效應(yīng)成分，其中一種鑒定為羥基紅花黃色素A或其同分異構(gòu)體;從紅花注射液D-5組分中篩選出與血小板結(jié)合的效應(yīng)成分主要有13個(gè)，其中一種鑒定為6-羥基山萘酚-3-氧葡萄糖苷。
　　3.分離得到三種與血小板結(jié)合效應(yīng)成分:羥基紅花黃色素A、紅花黃色素B及6-羥基山萘酚-3-氧葡萄糖苷。在分離純化HSYA的

7、過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)黃色色帶都與HSYA對(duì)照品具有相同Rf值，經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁以及圓二色譜等波譜學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定兩個(gè)化合物（化合物Ⅰ、化合物Ⅱ）的結(jié)構(gòu)比較相似，互為非對(duì)映異構(gòu)體。
　　4.通過(guò)大鼠體外抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用及對(duì)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)與血小板結(jié)合效應(yīng)成分的抗血栓作用。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:化合物Ⅰ、6-羥基山萘酚-3-氧葡萄糖苷及紅花黃色素B對(duì)ADP誘導(dǎo)

8、的家兔血小板聚集具明顯的抑制作用，且可明顯延長(zhǎng)大鼠血漿PT和家兔血漿APTT，提示化合物Ⅰ，紅花黃色素B及6-羥基山萘酚-3-氧葡萄糖苷對(duì)內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)均具抑制作用。但化合物Ⅱ?qū)DP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集則具有明顯促進(jìn)作用，可延長(zhǎng)大鼠血漿PT作用，但可縮短大鼠血漿APTT作用，提示化合物Ⅱ?qū)ν庠葱阅到y(tǒng)具有抑制作用，但對(duì)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)具有促進(jìn)作用。
　　本文采用血小板細(xì)胞固相萃取法從紅花注射液中篩選出16種與血小板結(jié)合的