人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其移植對(duì)再生障礙性貧血小鼠治療作用的研究.pdf

1、第一部分人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究
　　目的：建立從人的臍帶組織中分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs）的方法，并探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法：1.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定：分別采用植塊法和酶聯(lián)合消化法(膠原酶Ⅱ和胰酶)分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代以后的UC-MSCs表面

2、特異標(biāo)志物表達(dá)。2.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖能力的觀察：MTT法檢測(cè)P3、P10細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3、P10細(xì)胞生長(zhǎng)周期，比較兩代細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力有無變化。3. UC-MSCs誘導(dǎo)分化：選取狀態(tài)較穩(wěn)定的第4代細(xì)胞，以2×104/mL接種于放置有多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到一定的融合度時(shí)，以相應(yīng)的誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞分化。待脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)體系的胞質(zhì)中有脂滴形成時(shí)，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.375％油紅 O

3、染色；骨細(xì)胞誘導(dǎo)3周后，茜素紅染色，顯微鏡下觀察、拍照。4. RT-PCR法檢測(cè)UC-MSCs中SCF、G-CSF、GM-CSF、VEGF mRNA的表達(dá)。5. UC-MSCs同健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率，觀察UC-MSCs對(duì)健康人淋巴細(xì)胞增殖的影響；用Hoechst與PI雙染色來觀察UC-MSCs和健康人淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)UC-MSCs的變化。結(jié)果：植塊法培養(yǎng)1周左右可見成纖維樣細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，成簇生

4、長(zhǎng)；酶消化法3-5天可見成纖維樣細(xì)胞均勻生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)后，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形、旋渦狀生長(zhǎng)；細(xì)胞核大，核仁清晰；免疫表型分析顯示，CD29陽(yáng)性率（95.71±2.23）%，CD31和CD34陽(yáng)性率分別為（2.47±0.54）%和（3.24±0.34）%；第10代UC-MSCs仍具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，且第3、10代細(xì)胞周期無明顯變化；UC-MSCs在體外具有向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞分化潛能，可表達(dá)SCF、VEGF、G-CSF和GM-CS

5、F mRNA。UC-MSCs在體外對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)具有抑制作用，且呈細(xì)胞數(shù)量劑量依賴性，而淋巴細(xì)胞對(duì)UC-MSCs的生長(zhǎng)未見影響。結(jié)論：成功建立臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法；從臍帶中分離培養(yǎng)的細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　第二部分人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)再生障礙性貧血小鼠治療作用的研究
　　目的：探討人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）移植對(duì)藥物聯(lián)合射線誘導(dǎo)的再生障礙性貧血（aplastic anemia

6、, AA）模型小鼠的治療作用。方法：選用第6～7周的雌性昆明鼠120只，參照孫紀(jì)元等方法60Co-γ射線照射后iP環(huán)磷酰胺與氯霉素的復(fù)合法建立小鼠 AA模型。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、模型組及 MSC組。MSC組于造模后第2天從小鼠尾靜脈一次性輸注人UC-MSCs1×106/Kg，觀察各組小鼠生存率、外周血象、骨髓有核細(xì)胞數(shù)量、骨髓病理學(xué)特征等的變化。同時(shí)觀察模型鼠輸注UC-MSCs前后INF-γ量的變化以及造血細(xì)胞的集落數(shù)量的變化。結(jié)果：模型

7、組小鼠于第8天瀕臨死亡，第10天開始死亡，病理解剖發(fā)現(xiàn)各臟器色澤蒼白。生存率比MSC組低(P<0.05)。第10天WBC、PLT和RET明顯減少，RBC變化不明顯；16天時(shí)兩組外周血象指標(biāo)仍然很低，除 RBC繼續(xù)降低外，其他都輕度回升，而MSC組回升比模型組明顯，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模過程中，小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，晚期脂肪組織增生。輸注 UC-MSCs后，INF-γ量有所下降，MSC組骨髓有核細(xì)胞數(shù)、造血細(xì)胞集落中CFU-