富氫溶液對小鼠再生障礙性貧血的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 再生障礙性貧血是一種由于骨髓造血干細(xì)胞功能和數(shù)量改變而引起的以外周血全血細(xì)胞減少為主要臨床癥狀的血液疾病。目前認(rèn)為，免疫功能尤其是T細(xì)胞免疫功能紊亂是再障發(fā)生的主要機(jī)制。DC細(xì)胞作為專職抗原提呈細(xì)胞，通過攝取、加工處理和提呈抗原，從而激活T細(xì)胞。T細(xì)胞增殖活化，并選擇性高表達(dá)Th1、Th17、CD8+T細(xì)胞，低表達(dá)Th2、Treg細(xì)胞。Th1細(xì)胞一方面可以直接分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)骨髓衰竭;另一方面，Th1細(xì)胞可以促

2、進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖活化，從而介導(dǎo)造血干細(xì)胞的凋亡、壞死。Th17細(xì)胞可以通過自身分泌IL-10、IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子，從而破壞骨髓造血干細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可以通過穿孔素、顆粒酶、TNF等途徑殺死造血干細(xì)胞，從而導(dǎo)致骨髓衰竭。Treg作為一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在再障患者體內(nèi)表達(dá)降低，功能改變，從而喪失對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致自身免疫的過度反應(yīng)，從而導(dǎo)致再障的發(fā)生。
　　 目前，臨床治療再障的方法有:骨髓

3、移植療法、免疫抑制療法、雄激素療法等。雖然上述方法可以選擇性治療部分患者，但其毒副作用亦不容忽視。因此，尋找一種高效、低毒的新型治療藥物具有重要意義。
　　 2007年，Ohsawa等人研究發(fā)現(xiàn)氫氣可以選擇性清除羥自由基，發(fā)揮抗氧化作用。從此，世界范圍內(nèi)掀起了氫氣生物學(xué)研究的熱潮。大量研究表明，氫氣可以有效降低多種細(xì)胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL等，從而有效治療多種疾病。本教研室在初步研究氫氣的輻射防護(hù)作用基礎(chǔ)上，進(jìn)一步

4、研究了氫氣對血液疾病的治療，并且發(fā)現(xiàn)氫氣可以治療急性移植物抗宿主疾病。但是，關(guān)于氫氣對再生障礙性貧血的治療作用，未見研究報(bào)道。本課題以再障小鼠為研究對象，探討富氫溶液對再生障礙性貧血的治療作用及其機(jī)制研究。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.小鼠再生障礙性貧血模型的建立
　　 2.富氫溶液對再障小鼠體重的影響
　　 3.富氫溶液對再障小鼠外周血的影響
　　 富氫溶液對小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、血

5、紅蛋白的影響
　　 4.富氫溶液對再障小鼠骨髓的影響
　　 4.1、富氫溶液對再障小鼠骨髓有核細(xì)胞的影響
　　 4.2、富氫溶液對再障小鼠骨髓微環(huán)境的影響
　　 4.3、富氫溶液對再障小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的影響
　　 5.富氫溶液對再障小鼠造血干細(xì)胞的影響
　　 5.1、富氫溶液對再障小鼠脾結(jié)節(jié)的影響
　　 5.2、富氫溶液對再障小鼠粒結(jié)節(jié)的影響
　　 6.富氫溶液對再障小鼠免

6、疫系統(tǒng)的影響
　　 6.1、富氫溶液對再障小鼠T細(xì)胞的影響
　　 6.2、富氫溶液對再障小鼠TNF-α、IFN-γ、IL的影響
　　 研究方法:
　　 1.富氫溶液的制備:將高純度的氫氣緩緩灌入生理鹽水中，氣體與液體的體積比為1∶2，在0.4個(gè)大氣壓下2小時(shí)過飽和于生理鹽水中。緩緩減壓，再經(jīng)過半小時(shí)，加壓艙的氣壓降至常壓是，將生理鹽水袋取出，存放于4度冰箱中備用。
　　 2.再障模型的建立:采用5

7、.0Gy照射+尾靜脈注射淋巴細(xì)胞的免疫介導(dǎo)方法建立再生障礙性貧血?jiǎng)游锬Ｐ?8-12周CByB6F1小鼠，一次全身照射5.0Gy，照后4小時(shí)之內(nèi)尾靜脈注射C57BL/6小鼠淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞混合液0.2ml(5*106/0.2mL)。
　　 3.再障小鼠體重的檢測:使用電子秤于每天固定時(shí)間稱量各組小鼠體重并記錄，持續(xù)28天。
　　 4.再障小鼠外周血的檢測:眼球取血，并用血常規(guī)檢測儀檢測各組小鼠外周血各指標(biāo)的改變。
　　

8、 5.再障小鼠骨髓的檢測
　　 5.1再障小鼠骨髓有核細(xì)胞的檢測:取小鼠股骨，用培養(yǎng)基沖出骨髓有核細(xì)胞，稀釋，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。
　　 5.2再障小鼠骨髓微環(huán)境的檢測:取小鼠股骨，使用H-E染色觀察小鼠股骨結(jié)構(gòu)及其腔內(nèi)細(xì)胞的改變。
　　 5.3再障小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的檢測:取小鼠股骨，使用Tunel染色檢測小鼠骨髓腔內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。
　　 6.再障小鼠造血干細(xì)胞的檢測
　　 6.1再障小鼠脾結(jié)節(jié)的檢

9、測:取小鼠骨髓細(xì)胞，尾靜脈注射于5Gy照射小鼠，14天后去脾臟并計(jì)脾結(jié)節(jié)數(shù)。
　　 6.2再障小鼠粒結(jié)節(jié)的檢測:取小鼠骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)于甲基纖維素培養(yǎng)基中，12天后臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。
　　 7.再障小鼠免疫系統(tǒng)的檢測
　　 7.1再障小鼠脾臟T細(xì)胞的檢測:取小鼠脾臟，研磨為單細(xì)胞，抗體標(biāo)記CD4、CD8細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。
　　 7.2再障小鼠脾臟CD4+細(xì)胞各亞型的檢測:取小鼠脾臟，研磨為單細(xì)胞，提取

10、RNA，進(jìn)行Real-Time PCR檢測Th1、Th2、Treg、 Th17。
　　 7.3再障小鼠CD4+細(xì)胞各亞型相關(guān)細(xì)胞因子的檢測:取小鼠脾臟，研磨為單細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行Real-Time PCR檢測相關(guān)細(xì)胞因子。
　　 7.4再障小鼠血清細(xì)胞因子的檢測:取小鼠外周血，離心并收集血清，使用ELISE檢測小鼠外周血血清TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.富氫溶液

11、對再障小鼠體重的影響
　　 再障小鼠持續(xù)給氫28天后，其體重顯著高于未給氫組(P＜0.05)，表明氫氣可以改善再障小鼠的生存情況。
　　 2.富氫溶液對再障小鼠外周血的影響
　　 再障小鼠持續(xù)給氫28天后，眼球取血，并使用血常規(guī)檢測儀檢測外周血各指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)給氫組紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白都高于未給氫組，初步表明富氫溶液可以治療再生障礙性貧血。
　　 3.富氫溶液對再障小鼠骨髓的影響
　　 3

12、.1再障小鼠持續(xù)給氫28天后，取小鼠骨髓細(xì)胞，破紅后計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)給氫組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)顯著高于未給氫組(P＜0.05），表明富氫溶液可以緩減再障小鼠的骨髓相的改變。
　　 3.2再障小鼠持續(xù)給氫28天后，取小鼠股骨做H-E染色切片，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，給氫組小鼠骨髓腔內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)顯著多于未給氫組，且充血情況得到明顯改善，表明富氫溶液可以改善骨髓腔內(nèi)環(huán)境，從而達(dá)到治療再障的目的。
　　 3.3再障小鼠持續(xù)給氫28天后，取小鼠股骨

13、做Tunel染色切片，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，給氫組小鼠骨髓腔內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于未給氫組，表明富氫溶液可以緩減免疫系統(tǒng)對骨髓細(xì)胞的破壞。
　　 4.富氫溶液對再障小鼠造血干細(xì)胞的影響
　　 4.1再障小鼠持續(xù)給氫28天后，取小鼠骨髓細(xì)胞做脾結(jié)節(jié)，發(fā)現(xiàn)給氫組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)明顯高于未給氫組，表明富氫溶液可以改善再障小鼠的造血能力。
　　 4.2再障小鼠持續(xù)給氫28天后，取小鼠骨髓細(xì)胞做粒結(jié)節(jié)，發(fā)現(xiàn)給氫組小鼠粒結(jié)節(jié)數(shù)顯著高于未給

14、氫組，同樣表明富氫溶液可以改善再障小鼠骨髓造血干細(xì)胞增殖能力。
　　 5.富氫溶液對再障小鼠免疫系統(tǒng)的影響
　　 5.1再障小鼠持續(xù)給氫14天后，取小鼠脾臟檢測CD4、CD8，檢測發(fā)現(xiàn)CD4、CD8含量明顯低于未給氫組，且CD4/CD8趨近于正常組。
　　 5.2再障小鼠持續(xù)給氫14天后，取小鼠脾臟做PCR，檢測發(fā)現(xiàn)給氫組轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Foxp3、RORγt表達(dá)顯著低于未給氫組，而GATA3表達(dá)量則高于未給

15、氫組。
　　 5.3再障小鼠持續(xù)給氫14天后，取小鼠脾臟做PCR，檢測發(fā)現(xiàn)給氫組Th1細(xì)胞相關(guān)因子IFN-γ、IL-12、TGF-β1表達(dá)量顯著降低;Th2細(xì)胞相關(guān)因子IL-4表達(dá)量降低，而IL-5、IL-10表達(dá)量增高;Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17與IL-23表達(dá)量顯著降低。
　　 5.4再障小鼠持續(xù)給氫14天后，取小鼠血清檢測TNF-α、IFN-γ、IL-6，發(fā)現(xiàn)給氫組血清TNF-α、IFN-γ、IL-6水平顯著低

16、于未給氫組(P＜0.05)。
　　 分析討論:
　　 再生障礙性貧血是一種血液科常見疾病。我們從外周血、骨髓相、免疫系統(tǒng)三方面研究了富氫溶液對再障的治療作用。結(jié)果顯示，氫氣可以顯著改善外周血各項(xiàng)指標(biāo)，提高外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白的含量。外周血各項(xiàng)指標(biāo)尤其是紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白的改善是再障得到有效治療的直接指標(biāo)。骨髓微環(huán)境的改變和骨髓造血干細(xì)胞的缺失是再障發(fā)生的主要原因。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，氫氣可以改善

17、再障小鼠骨髓微環(huán)境，增加骨髓有核細(xì)胞數(shù)量，減少骨髓凋亡細(xì)胞，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞的恢復(fù)。免疫功能尤其是細(xì)胞免疫功能的紊亂是再障發(fā)生的主要病理機(jī)制。免疫功能的恢復(fù)可以從根本上治療再障患者。研究發(fā)現(xiàn)，氫氣可以降低脾臟CD4、CD8的含量，調(diào)節(jié)CD4與CD8比值，介導(dǎo)CD4細(xì)胞各亞型的表達(dá)，調(diào)節(jié)血清TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量，從而介導(dǎo)免疫系統(tǒng)，達(dá)到治療再障的目的。
　　 結(jié)論:
　　 我們發(fā)現(xiàn)氫氣可以有效治療再障小鼠