甘草酸對涎腺腺樣囊性癌SACC-M細(xì)胞系增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的惡性腫瘤之一，在口腔頜面部惡性腫瘤中居第二位。浸潤性極強和易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腺樣囊性癌的重要特征。即使手術(shù)切除后也常有局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率在口腔頜面部居首位。涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機制目前尚不清楚。因此有必要探索新的治療方法，以期提高對腺樣囊性癌的療效，減少局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，改善患者的生存質(zhì)量。中藥甘草，系

2、雙子葉植物豆科多年生草本植物，是我國著名的傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用最為廣泛，甘草酸（Glycyrrhizic Acid，GA）是其主要活性成分之一。如今，甘草廣泛應(yīng)用于抗炎、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、治療消化性潰瘍以及保護(hù)神經(jīng)等方面，近年來相繼有研究顯示甘草及其主要成分具有抗腫瘤的作用，但甘草酸是否有誘導(dǎo)腺樣囊性癌細(xì)胞凋亡的作用，國內(nèi)外尚未見報道。本研究擬對體外培養(yǎng)的人涎腺腺樣囊性癌SACC-M細(xì)胞經(jīng)不同濃度、不同時間甘草酸作用后，觀察不

3、同濃度、不同作用時間下甘草對人涎腺腺樣囊性癌SACC-M細(xì)胞系是否具有抑制其增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用，探討其可能的機制，并為臨床上采用甘草酸治療涎腺腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.材料
　　 SACC-M:上海交通大學(xué)口腔頜面外科實驗室提供，建立于1995年；
　　 甘草酸：東京化成工業(yè)株式會社(TCI)，純度為97％（HPLC）
　　 2.方法
　　 (1)藥液配制

4、甘草酸用RPMI1640培養(yǎng)液配制成25mmol/L儲存液，使用前用1640培養(yǎng)液稀釋。
　　 (2)細(xì)胞培養(yǎng)：采用RPMI1640培養(yǎng)基加入10％胎牛血清和青霉素(100U/ml)、鏈霉素（100μg/ml），于37℃、5％CO2恒溫箱內(nèi)飽和濕度培養(yǎng)，24～48小時傳1代，以0.04％EDTA和0.25％胰蛋白酶(1∶1)混合液消化傳代。
　　 (3)MTT比色試驗：取對數(shù)生長期細(xì)胞制成2.0×105/mL細(xì)胞懸液，接

5、種于96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h后，分別加入甘草酸溶液100μ1，使終濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mmol/L，并設(shè)對照組和調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μl,再培養(yǎng)4h后吸去全部上清液，而后每孔加入200μl二甲基亞砜，振蕩搖勻，使結(jié)晶充分溶解后，置酶標(biāo)儀上測各孔吸光度值，并計算生長抑制率。
　　 (4)倒置相差顯微鏡觀察：將細(xì)胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中，于倒置

6、鏡下觀察細(xì)胞在空白及含藥培養(yǎng)基中，培養(yǎng)不同時間后的生長狀況。
　　 (5)光鏡觀察：在6孔板中放置蓋玻片，將細(xì)胞接種于其中，爬片成功后加入空白或含藥培養(yǎng)基，培養(yǎng)不同時間后，Giemsa染色，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 (6)流式細(xì)胞術(shù)檢測：空白培養(yǎng)基和不同濃度的含藥培養(yǎng)基將細(xì)胞處理不同時間后，使用Annexin-V-FITC和PI雙標(biāo)記活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　 3.統(tǒng)計分析
　　 使用SP

7、SS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件，應(yīng)用方差分析、相關(guān)分析以及u檢驗對生長抑制率和凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT比色試驗：甘草酸對SACC-M細(xì)胞具有明顯的抑制生長作用，最大生長抑制率可達(dá)80.4％。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，不同濃度用藥組處理不同時間之間生長抑制率不同（P＜0.01），藥效與藥物濃度以及作用時間之間具有明顯的正相關(guān)性。
　　 2.倒置顯微鏡觀察：對照組的細(xì)胞貼壁生長，生長速度快，呈扁平多角形，胞

8、質(zhì)飽滿，靠近細(xì)胞中央處有圓形的細(xì)胞核；用藥組的細(xì)胞生長速度明顯減慢，并且可見有細(xì)胞脫壁，貼璧的細(xì)胞變圓，胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞變小，細(xì)胞間連接松解，核顏色加深，細(xì)胞的折光性增強。
　　 3.光鏡觀察：對照組的細(xì)胞大，核漿比例大，并可見多個核仁；而用藥組胞質(zhì)濃縮，核漿比例降低，核仁減少甚至消失，出現(xiàn)染色質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的現(xiàn)象，并且可見細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測：對照組也有細(xì)胞凋亡，但是凋亡率較低；用藥組細(xì)胞明顯凋亡