放射線對涎腺腺樣囊性癌細胞NF-κB-P65蛋白表達與細胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景:
　　 涎腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma of salivary glands,ACCs)又稱圓柱瘤(cylindroma),是一種口腔科常見的惡性涎腺上皮來源性腫瘤。它有著局部侵襲性強,區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低,嗜神經(jīng)血管生長,因而易發(fā)生血行遠處轉(zhuǎn)移等生物學特性,惡性程度高,放療敏感性卻較低。正是緣于此,該腫瘤被手術(shù)切除后有著較高的復發(fā)率。如能引入基因治療的方法,提高腺樣囊性癌對放療的敏感程

2、度,則能夠給患者的生存率帶來明顯的改善。由于NF-kB信號轉(zhuǎn)導通路的激活可能是腫瘤產(chǎn)生放療抵抗性的主要根源之一,通過基因工程技術(shù)阻斷該通路的表達活性或許能夠起到提高腺樣囊性癌細胞對放療敏感性的作用。
　　 研究目的:
　　 對唾液腺腺樣囊性癌ACC-2細胞進行高能X線照射后,在不同時間點上,通過多種方法檢測細胞中NF-kB信號轉(zhuǎn)導通路亞單位--p65蛋白表達程度以及細胞凋亡情況,并探究兩者之間的相關(guān)性,從而獲得一系列圖像

3、與數(shù)據(jù)資料。為進一步的放療增敏實驗、動物實驗以及最終的臨床應用打下良好的基礎(chǔ)。
　　 實驗方法:
　　 復蘇并傳代培養(yǎng)ACC-2細胞系。在細胞進入對數(shù)生長期之后,對其進行2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy五種劑量高能X線照射。在隨后的1h、3h、6h、10h、24h、
　　 48h六個時間點上,分別采用以下四種不同的實驗方法來實現(xiàn)對NF-kB信號轉(zhuǎn)導通路活性的檢測和細胞凋亡的統(tǒng)計與觀察:通過免疫細胞化學法觀

4、察各放射劑量組P65蛋白在細胞中的表達隨時間和空間變化的情況,并拍攝留取圖片資料；通過免疫蛋白印漬(western blotting)法,對細胞中P65蛋白含量進行半定量檢測,以獲取其在受到放射線照射后表達量的遞變規(guī)律；最后,對不同時間點上細胞凋亡率采用流式細胞檢測予以測定,進行TUNEL(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記技術(shù))試驗來觀察發(fā)生凋亡細胞核的形態(tài),并拍攝留取圖片資料。以上各實驗過程均嚴格控制細胞生長的外環(huán)境,并設置

5、不接受放射線照射的空白對照組細胞,關(guān)鍵步驟另重復兩遍以減少系統(tǒng)誤差,采用必要的統(tǒng)計學方法對數(shù)據(jù)進行進行檢驗分析。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.通過免疫細胞化學法可觀察到,正常對照組細胞中P65蛋白很少出現(xiàn)在細胞核內(nèi),而多被定位于核周的細胞質(zhì)之中；在受到放射線照射后,該蛋白開始大量穿過胞膜,漸漸進入細胞核中心區(qū)域,這一過程在放射劑量高的組比放射劑量低的組進展更快；
　　 2.借助于western blotting,

6、P65蛋白在細胞總蛋白中的含量被發(fā)現(xiàn)可隨著時間逐漸發(fā)生變化,其在各組細胞中表達的峰值大約在放療后6小時～10小時。同在照射后3小時時間點上,隨著放療劑量的增大,P65蛋白含量也與之俱增。
　　 3.經(jīng)過分析流式細胞檢測的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn):在不同時間點上,細胞凋亡率不斷地改變,該實驗數(shù)據(jù)被繪制成曲線后,可見各放射劑量組細胞凋亡曲線的最低點位于放療后10小時；同樣在照射后3小時時間點上,細胞凋亡率隨放射劑量的增加而有所降低,對照west

7、ern b10tting結(jié)果,則表現(xiàn)出了其相對于P65蛋白含量的負相關(guān)關(guān)系(應用Spearman等級相關(guān)法進行放射線照射劑量強度與細胞凋亡率之間關(guān)系的分析；檢驗水準取雙側(cè)α=0.05,結(jié)果P=0.010<0.05)。
　　 4.發(fā)生凋亡的細胞在TUNEL試驗中被觀察到了較為典型的形態(tài)學變化,如染色體濃集、核碎裂以及凋亡小體等,凋亡細胞比率的變化趨勢與流式細胞檢測的結(jié)果相同。
　　 研究結(jié)論:
　　 高能X射線與A

8、CC-2細胞中P65蛋白的表達變化規(guī)律之間有著一定的時間--劑量效應關(guān)系。即細胞受到放射線照射之后,隨時間推移,P65蛋白在空間上濃集的部位不斷遷移,最終富集作用于細胞核相關(guān)區(qū)域,即特定部位與特定時間相對應；其在總蛋白中的含量亦不斷改變,即特定含量對應特定時間,此為放射線與P65蛋白表達的時間效應關(guān)系。而放射線劑量的增大可以加速同一時間點上蛋白濃集部位的遷移過程,并可使蛋白含量隨之升高,此為二者正相關(guān)的劑量效應關(guān)系。照射后各組細胞凋亡率