抑制HES1、HEY1對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞功能的影響.pdf

1、涎腺腺樣囊性癌（SACC）是好發(fā)于腮腺、頜下腺及小涎腺的口腔頜面部惡性腫瘤之一，具有嗜神經(jīng)侵襲以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移兩大生物學(xué)特性，其臨床生物學(xué)特性表現(xiàn)為感覺(jué)和（或）運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙，易通過(guò)血行轉(zhuǎn)移至肺，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。本課題組通過(guò)前期大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通路中的受體基因Notch1能夠作為促癌基因促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌的增殖、侵襲及遷移。國(guó)內(nèi)外眾多研究表明，HES1、HEY1基因是Notch1信號(hào)通

2、路的下游基因，二者可能在多種腫瘤的發(fā)展演化中發(fā)揮著癌基因的作用。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，篩選出 Notch1信號(hào)通路的下游基因 HES1、HEY1，研究其與涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的關(guān)系并對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行探討。本研究按照基因的篩選和細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)分為兩部分，分述如下：
　　一、在SACC細(xì)胞中利用Real-time PCR技術(shù)篩選出與Notch1變化相關(guān)的下游基因，并在組織水平驗(yàn)證其表達(dá)。
　　目的：篩選與

3、Notch1表達(dá)變化相關(guān)的下游靶基因。
　　方法：根據(jù)文獻(xiàn)選取的常見(jiàn)的Notch1的下游基因設(shè)計(jì)引物。用Notch1的siRNA轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞，通過(guò)Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)Notch1下游基因的表達(dá)量；構(gòu)建Notch1基因重組腺病毒表達(dá)載體，感染SACC-83細(xì)胞，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)研究其下游基因的表達(dá)變化。收集涎腺腺樣囊性癌組織和癌旁組織的石蠟標(biāo)本，利用篩選出的下游基因的相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫組化，經(jīng)

4、2名病理科醫(yī)師閱片評(píng)分后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
　　結(jié)果：Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Notch1表達(dá)下降后，HES1、HEY1的表達(dá)也相應(yīng)降低；而Notch1表達(dá)升高后，HES1、HEY1的表達(dá)也隨之上升。涎腺腺樣囊性癌癌組織標(biāo)本中HES1、HEY1的表達(dá)高于癌旁組織。
　　結(jié)論：HES1、HEY1的表達(dá)變化與Notch1的表達(dá)變化呈正相關(guān)關(guān)系。
　　二、利用siRNA干擾技術(shù)探討HES1、HEY1對(duì)SACC細(xì)胞功能的

5、影響。
　　目的：研究 HES1、HEY1在SACC細(xì)胞增殖、侵襲以及遷移中的作用。
　　方法：設(shè)計(jì)合成HES1、HEY1的siRNA，轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞，HES1、HEY1的表達(dá)量的變化通過(guò)Real-time PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出兩條干擾有效的siRNA，轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞使其HES1、HEY1的表達(dá)顯著下調(diào)后，采用CCK8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞增殖能力的變化；采用細(xì)胞劃痕愈合法研究細(xì)胞遷移能力的變化；

6、采用侵襲小室法研究細(xì)胞侵襲能力的變化；采用流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞周期和凋亡的變化。
　　結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示HES1、HEY1表達(dá)下降；CCK8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)HES1、HEY1轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增殖能力弱于陰性對(duì)照組；侵襲小室、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HES1、HEY1表達(dá)下降后，SACC-83細(xì)胞的侵襲、遷移能力也隨之下降；流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HES1、HEY1后細(xì)胞的早期和晚期凋亡率升高，而細(xì)胞周期和對(duì)照組