AMPK激活誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株細(xì)胞周期停滯和增殖抑制.pdf

1、背景及目的：
　　食管癌是我國消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，尤以河南林縣和廣東潮汕地區(qū)為高發(fā)，化學(xué)治療是治療食管癌的重要手段之一，但傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的副作用嚴(yán)重阻礙了化學(xué)治療的發(fā)展與應(yīng)用。尋找一種能夠抗腫瘤同時(shí)盡量減少對(duì)正常細(xì)胞損傷的藥物，對(duì)有效的預(yù)防和治療食管癌具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶，是細(xì)胞能量調(diào)節(jié)的感

2、受器?，F(xiàn)已證明服用AMPK激活的降糖藥物二甲雙胍，可顯著降低消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率。已有研究顯示，AMPK激活劑對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌等具有抑制生長、誘導(dǎo)凋亡等作用，而AMPK激活對(duì)人食管癌細(xì)胞是否也存在抑制作用，是否調(diào)節(jié)人食管癌細(xì)胞周期，尚未見報(bào)道。本研究將通過AMPK的激活劑二甲雙胍和AICAR對(duì)人食管癌細(xì)胞株Eca109和Eca9706細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響及其分子機(jī)制的研究，探討AMPK激活對(duì)人食管癌細(xì)胞的治療意義，為A

3、MPK成為食管癌治療的新靶點(diǎn)提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞株 Eca109、Eca9706細(xì)胞及人宮頸癌細(xì)胞株 HeLa細(xì)胞(陰性對(duì)照， LKB1-AMPK缺乏細(xì)胞)。
　　2.用含不同濃度二甲雙胍(0、2.5、5.0、10、20mM)，AICAR（0、250、500、1000、2000μM）的培

4、養(yǎng)基分別處理 Eca109和Eca9706細(xì)胞24、48、72h；用含不同濃度的Compound C（0、5、7.5、10μM）的培養(yǎng)基處理Eca109細(xì)胞30min后，用含二甲雙胍（10mM）， AICAR（1000μM）的培養(yǎng)基處理24h；用含10mM的二甲雙胍培養(yǎng)基和1000μM的AICAR的培養(yǎng)基分別處理HeLa細(xì)胞24、48、72h，以未予藥物處理細(xì)胞作對(duì)照；噻唑藍(lán)比色法(MTT法)檢測(cè)二甲雙胍及 AICAR對(duì) Eca109、

5、Eca9706及 HeLa細(xì)胞增殖的影響及Compound C的拮抗作用。
　　3.用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和1000μM的AICAR的培養(yǎng)基分別處理 Eca109和Eca9706細(xì)胞24h，經(jīng)碘化丙啶（PI）單染法，用流式細(xì)胞分析儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
　　4.用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和1000μM的AICAR的培養(yǎng)基分別作用于Eca109和Eca9706細(xì)胞24h，以未予藥物處理細(xì)胞為對(duì)照，Weste

6、rn Blot檢測(cè)AMPK磷酸化程度、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21CIP、p27KIP表達(dá)量。
　　5.用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和1000μM的AICAR的培養(yǎng)基分別處理 Eca109和Eca9706細(xì)胞24h，DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍及AICAR處理24h后，Eca109和Eca9706細(xì)胞AMPK磷酸化程度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。
　　2.二甲雙胍及AICAR顯著性抑制Eca10

7、9和Eca9706細(xì)胞的生長，并且呈濃度、時(shí)間依賴性；Compound C能拮抗二甲雙胍和AICAR的增殖抑制作用；而二甲雙胍及AICAR對(duì)HeLa細(xì)胞的生長無抑制作用。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Eca109和Eca9706細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR處理24h后，細(xì)胞周期發(fā)生G0-G1期停滯。
　　4.二甲雙胍及AICAR處理24h后，Eca109細(xì)胞p21CIP和p27KIP表達(dá)比對(duì)照組顯著增強(qiáng)。
　　5.

8、Eca109和Eca9706細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR處理24h后，DAPI染色顯示細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　1. AMPK激活誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖抑制。
　　2. AMPK激活誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株細(xì)胞發(fā)生G0-G1期細(xì)胞周期停滯。
　　3. AMPK激活上調(diào)人食管癌細(xì)胞株細(xì)胞p21CIP、p27KIP表達(dá)量。
　　4. AMPK激活誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株細(xì)胞凋亡。
　　綜