DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型的代謝組學(xué)研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞性肝癌(簡(jiǎn)稱肝癌，Hepatocellular Carcinoma，HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前的研究認(rèn)為：肝炎病毒感染及其他致癌因素是肝癌發(fā)生的主要外因。同時(shí)，肝癌和其它惡性腫瘤一樣，其發(fā)生發(fā)展是由體內(nèi)多基因多蛋白參與、多步驟協(xié)同的復(fù)雜過(guò)程。尋找肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的相關(guān)代謝產(chǎn)物有助于研究肝癌發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制，從而為肝癌的預(yù)防、診斷及治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 組學(xué)概念的提出為研究者提供了一個(gè)整體研究疾病

2、的新思路，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等已經(jīng)不為大家所陌生，作為系統(tǒng)生物學(xué)最下游的代謝組學(xué)，是一門(mén)新的科學(xué)，主要研究生物體對(duì)病理生理刺激或基因修飾所產(chǎn)生代謝物的質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。這種整體的研究模式可全面了解代謝物質(zhì)在疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律，對(duì)發(fā)病機(jī)制研究以及疾病的診斷、治療和療效評(píng)估具有重要意義。因此，我們采用該理論，結(jié)合現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)DEN誘導(dǎo)大鼠肝炎—肝硬化—肝癌模型以及慢性肝炎、肝硬化和肝癌病人進(jìn)行代謝組學(xué)研究。

3、
　　 本研究擬首先通過(guò)DEN誘導(dǎo)建立大鼠肝炎—肝硬化—肝癌動(dòng)物模型，觀察在不同發(fā)展階段血漿代謝小分子的變化情況，從中找出不同發(fā)展階段大鼠血漿中潛在的代謝物分子標(biāo)簽；然后對(duì)模型肝臟組織進(jìn)行代謝組研究，并與疾病的發(fā)展階段進(jìn)行關(guān)聯(lián)；最后將這些代謝物分子標(biāo)簽在人血漿中進(jìn)行驗(yàn)證，觀察其對(duì)肝癌的預(yù)測(cè)能力。
　　 方法：
　　 1.建立DEN誘導(dǎo)大鼠肝炎—肝硬化—肝癌模型；
　　 2.模型不同階段大鼠血漿的代謝組檢測(cè)

4、；
　　 3.基于大鼠血漿代謝組的預(yù)測(cè)模型建立；
　　 4.潛在大鼠血漿代謝產(chǎn)物分子標(biāo)志物的篩選及鑒定；
　　 5.模型不同階段大鼠肝臟組織的代謝組檢測(cè)；
　　 6.基于大鼠肝臟組織代謝組的預(yù)測(cè)模型建立；
　　 7.潛在血漿代謝產(chǎn)物分子標(biāo)志物在肝炎、肝硬化、肝癌病人血漿中的驗(yàn)證及篩選。
　　 結(jié)論：
　　 本研究采用液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)(LC-MS)，對(duì)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌動(dòng)

5、物模型血漿及肝臟組織進(jìn)行代謝組學(xué)研究，篩選出區(qū)分肝癌與非肝癌的50個(gè)代謝產(chǎn)物，與肝炎、肝硬化及肝癌病人的血漿代謝組數(shù)據(jù)比較，最終尋找到5個(gè)潛在代謝標(biāo)志物：二氫(神經(jīng))鞘氨醇，棕櫚酰肉堿，一種膽汁酸衍生物，溶血磷脂酰膽堿，以及溶血磷脂酰乙醇胺。研究結(jié)果為尋找肝癌分子標(biāo)志物、肝癌代謝相關(guān)通路研究及肝癌的診斷提供了新的思路與方法。
　　 第二部分 Hedgehog信號(hào)通路在肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用
　　 目的：肝內(nèi)膽管癌(I

6、ntrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC)，又稱膽管細(xì)胞癌或周?chē)湍懝馨?，是?lái)自肝內(nèi)二級(jí)分支以下膽管樹(shù)上皮的腫瘤。在世界范圍內(nèi)，肝內(nèi)膽管癌是僅次于肝細(xì)胞癌的第二大肝臟惡性腫瘤，占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的10％～20％，其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)。肝內(nèi)膽管癌具有發(fā)生隱匿、惡性程度高、發(fā)展迅速、手術(shù)切除率低、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移早、臨床預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量及生存率。以往對(duì)這類非肝細(xì)胞起源的肝臟惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)

7、程缺乏系統(tǒng)的了解，研究水平也相對(duì)滯后。因此針對(duì)臨床肝內(nèi)膽管癌診治中的難點(diǎn)進(jìn)行深入研究，尤其是研究其發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以尋找新的有效的肝內(nèi)膽管癌特異性治療方法十分必要。
　　 Hedgehog(Hh)基因是編碼一系列分泌蛋白的基因家族，1980年首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最早被發(fā)現(xiàn)對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞分化和增殖起重要作用。近年來(lái)通過(guò)對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑深入研究，發(fā)現(xiàn)Hh通路的異常在人類腫瘤的形成中也有極其重要

8、的作用。HH基因在不同組織中過(guò)度表達(dá)以及靶基因突變，均可導(dǎo)致細(xì)胞特異性的組織增生，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Hh通路與腫瘤的關(guān)系最早在Glioma中被證實(shí)，其與腦部神經(jīng)瘤的形成聯(lián)系密切，后又發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)異常與基底細(xì)胞癌、肺癌、前列腺癌、口腔癌和消化道腫瘤等的形成均有重要關(guān)系。
　　 Hh信號(hào)通路在肝臟發(fā)育、細(xì)胞分化以及腫瘤發(fā)生上均起重要作用，本實(shí)驗(yàn)擬分析Hh信號(hào)通路相關(guān)分子在肝內(nèi)膽管癌組織及肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá)，體內(nèi)外調(diào)節(jié)Hh信

9、號(hào)通路觀察其對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響，并分析Hh信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄分子Gli1、Gli2表達(dá)水平與肝內(nèi)膽管癌病人臨床病理資料及預(yù)后的相關(guān)性。以上工作有助全面揭示肝內(nèi)膽管癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，深化對(duì)Hh信號(hào)通路的認(rèn)識(shí)，為尋找肝內(nèi)膽管癌新治療靶點(diǎn)提供線索和思路。
　　 方法：
　　 1.Real-time PCR檢測(cè)正常肝內(nèi)膽管上皮組織與對(duì)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中Hh通路信號(hào)分子的mRNA表達(dá)水平；
　　 2.

10、免疫組織化學(xué)檢測(cè)正常肝內(nèi)膽管上皮組織與對(duì)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中Hh通路信號(hào)分子的蛋白表達(dá)水平；
　　 3.體外用小分子化合物改變Hh信號(hào)通路的活性，觀察其對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響；
　　 4.體內(nèi)用小分子化合物改變Hh信號(hào)通路的活性，觀察其對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響；
　　 5.Hh通路信號(hào)分子與肝內(nèi)膽管癌病人臨床病理資料及預(yù)后資料的統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)論：
　　 本研究從人肝內(nèi)膽

11、管癌組織標(biāo)本和體外培養(yǎng)的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系兩個(gè)方面，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路在其中異常激活；用Hh信號(hào)通路特異性抑制劑在體內(nèi)外改變通路活性，均能夠明顯抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系的增殖能力；肝內(nèi)膽管癌組織中Hh信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄分子Gli1的表達(dá)高低與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及病人預(yù)后密切相關(guān)，Gli2的表達(dá)高低與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、T分期及病人預(yù)后密切相關(guān)；Gli1的表達(dá)高低是肝內(nèi)膽管癌的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究可加深人們對(duì)肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展及其調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為研發(fā)肝